Материал: Kurs_Lektsiy_po_Biologii (1)

Полулетальные мутации резко понижают жизнеспособность организмов и мутантные особи, как правило, не доживают до репродуктивного периода, быстро погибая из-за плохо совместимого с жизнью наследственного дефекта. Условно летальные мутации могут вовсе не проявляться в одних условиях и вести организм к гибели в других условиях. К стерильным относят мутации, существенно не затрагивающие жизнеспособность, но резко уменьшающие фертильность, или плодовитость, мутантов.

Наконец, к нейтральным и усиливающим относят мутации, не связанные с жизнеспособностью и плодовитостью, либо усиливающие эти признаки.

По характеру изменения наследственного материала мутации делят на: генные, хромосомные и геномные.

Генные мутации

Генные или точечные мутации - это стойкие изменения в молекулярной структуре отдельных генов. По молекулярным механизмам генные мутации подразделяют на два основных типа: мутации, вызванные заменой одного нуклеотида на другой, и мутации со сдвигом рамки считывания. Нуклеотиды, из которых состоят молекулы ДНК, различаются только по азотистому основанию, что дает право рассматривать главное событие генных мутаций первого типа как замену одного азотистого основания на другое. На их долю приходится порядка 20% спонтанных генных мутаций. Если в результате мутации пуриновые основания заменяются пуриновыми, а пиримидиновые - пиримидиновыми, то эти замены называют транзициями. Возможны четыре вида транзиций: А↔Г, Т↔Ц. Замены пиримидиновых азотистых оснований на пуриновые и, наоборот, называют трансверсиями. Трансверсии могут быть восьми видов: А↔Т, А↔Ц, Г↔Ц, Г↔Т. У человека транзиции встречаются чаще чем трансверсии.

Замены одного азотистого основания в макромолекуле ДНК приводит к образованию нового триплета в нуклеотидной последовательности, кодирующей последовательность аминокислот в полипептиде. Мутации замены оснований приводят к появлению двух типов триплетов в ДНК и соответственно кодонов в и(м)РНК - с измененным смыслом (миссенс-мутации) и бессмысленного (нонсенс- мутации). Результатом миссенс-мутаций, ведущих к изменению кодирующих триплетов, может быть замена одной аминокислоты в полипептиде белка на другую, что может иметь серьезные последствия для организма.

Примером мутаций такого типа может служить появление гемоглобина S при серповидно-клеточной анемии у человека. Суть такой миссенс-мутации сводится к замене второго нуклеотида (Т) в триплете, кодирующем стоящую в β-цепи гемоглобина на 6-м месте глутаминовую кислоту (ЦТТ), на нуклеотид (А), превращающий его в триплет, кодирующий аминокислоту валин (ЦАТ). Замена только одной аминокислоты в β-цепи гемоглобина приводит к тому, что вместо нормального гемоглобина А, состоящего из двух идентичных α-цепей и двух идентичных β-цепей, синтезируется гемоглобин S.

Необходимо отметить, что в силу вырожденности генетического кода в 25% таких замен возникает триплет-синоним, что не дает изменений аминокислотной последовательности в соответствующем полипептиде. Таким образом, не всякая мутация в триплете приводит к замене аминокислоты. Такие мутации называют нейтральными.

К типу нонсенс-мутаций относят мутации, приводящие к замене оснований в триплетах ДНК, при которой кодон и(м)РНК, определяющий какую-либо аминокислоту, превращается в один из терминирующих триплетов (стоп-кодонов), не транслирующихся на рибосомах. Появление такого триплета внутри структурного гена приводит к преждевременной терминации транскрипции и обрыву полипептидной цепи. Например, кодон УАЦ на и(м)РНК кодирует аминокислоту тирозин. При замене цитозина на аденин возникает бессмысленный кодон (УАА), который обрывает синтез полипептидной цепи. Говоря об однонуклеотидных заменах необходимо отметить, что однонуклеотидные замены наиболее частые патогенные мутации в геноме человека. Большинство этих мутаций возникает в ходе репликации ДНК, точного, но подверженного ошибкам процесса.

Немалую часть спонтанных (самопроизвольных) мутаций составляют мутации по типу сдвига рамки считывания. Мутации со сдвигом рамки обусловлены встраиванием в нуклеотидную последовательность ДНК дополнительных нуклеотидов (нуклеотидных пар) - инсерция, или выпадение нуклеотидов (нуклеотидных пар) - делеция. При этом меняются все триплеты после сайта (места) инсерции и делеции, что приводит к сдвигу рамки считывания информации и цепь полипептида приобретает цепь неверных аминокислот.

Инсерции и делеции могут представлять собой и нонсенс-мутации, поскольку вызывают появление терминирующих кодонов (УАА, УАГ, УГА), поэтому последствия таких мутаций довольно серьезны.

К выпадению или вставкам нуклеотидов (пар нуклеотидов) приводят достаточно частые мутации в сайтах сплайсинга - на участках интронов и экзонов. Эти мутации проявляются в нарушении вырезания интронов из пре-и(м)РНК транскрипта. В результате созревающая и(м)РНК лишается части или всего экзона, а может привести к сохранению в и(м)РНК интронной нуклеотидной последовательности.

Недавно стали выделять еще одну группу генных мутаций по типу экспансии тринуклеотидных повторов. Они характеризуются нарастанием числа триплетных повторов в кодирующих или некодирующих участках гена (например, ЦТТ, ЦГГ или ЦАГ). Это приводит к появлению в молекуле полипептида «трека» из аминокислотных остатков какой-либо аминокислоты.

Надо иметь ввиду, что всякая генная мутация есть результат сложного многоэтапного процесса, инициированного появлением в ДНК того или иного первичного повреждения. С этой точки зрения первичное повреждение, происходящие в какой-либо нити молекулы ДНК, являются всего лишь первым этапом в процессе образования истинной мутации (в процессе фиксации мутации). Такими типами первичных повреждений (предмутационных повреждений) в ДНК служат следующие:

1) химические изменения азотистых оснований (дезаминирование, окисление, алкилирование);

2) потеря основания (депуринизация, депиримидинизация);

3) димеризация пиримидинов (образованием димеров);

4) однонитевые и двунитевые разрывы ДНК;

5) ошибка спаривания.

Эти повреждения возникают в естественных условиях (спонтанные повреждения) и при воздействии мутагенных факторов на хромосомы (индуцированные). Спонтанные повреждения возникают без каких-либо направленных воздействий, а индуцированные – под действием физических, химических или биологических факторов. Причем частота спонтанных повреждений очень высокая. Ежедневно у человека возникает 50 тысяч однонитевых разрывов, более 8 тысяч окисленных и алкилированных оснований, и еще в совокупности около 100 сложных повреждений (двунитевые разрывы, межмолекулярные сшивки ДНК-ДНК и ДНК-белок). Ежедневно в каждой клетке человека от 2 до 3 тысяч пуриновых и пиримидиновы нуклеотидов (на гаплоидный геном) теряют свои азотистые основания. В результате образуются АП-сайты (апуриновые и апиримидиновые) и сохраняется только дезоксирибоза и фосфодиэфирная связь.

Первичные повреждения могут происходить в разных фазах клеточного цикла. Молекула ДНК может изменяться во время ее синтеза. Это касается, например, ошибок спаривания, когда во время синтеза новой нити молекулы ДНК при репликации вставляется неверное основание, или аналог его. Могут возникать повреждения и в покоящейся молекуле ДНК в фазе G1 и G2, вызывая повреждения нитей ДНК.

Итак, повреждения в ДНК происходят до, после или в процессе репликации первоначально, как правило, в одной полинуклеотидной цепи. Появление таких первичных изменений еще не означает появление мутаций. Из общего числа первичных повреждений только часть их переходит в истинные мутации (фиксируется в мутации). Остальные устраняются механизмами молекулярной репарации (см. ниже). Результатом превращения первичных повреждений в истинные генные мутации (результатом фиксации мутаций) служит: появление замен пар оснований (пар нуклеотидов), вставка (инсерция) или делеция пар оснований (пар нуклеотидов), их перестановки (рис. 1).

В результате таких точечных мутаций искажается генетическая информация, она реализуется в неправильную последовательность аминокислот в соответствующих белках и ведет либо к появлению новых, отличающихся от нормы признаков (неоморфные мутации), либо к потере признака (аморфные мутации).

За появление спонтанных генных мутаций ответственны разные механизмы. Из них наиболее значимыми являются: ошибки репликации ДНК; неправильное спаривание оснований при кроссинговере; перемещение мобильных генетических элементов; нарушение процессов сплайсинга; генотоксическое действие продуктов метаболизма, повреждающих ДНК (активные формы кислорода и др.). Для естественного мутационного процесса имеет значение и уровень естественного фона радиации, который складывается из космических лучей, радиоактивных элементов поверхности Земли и радионуклидов, поступающих в организм.

Исследование спонтанных мутаций у различных организмов выявило некоторые закономерности. Во-первых, скорость спонтанного мутирования у разных организмов различна. Во-вторых, частота спонтанных мутаций в разных генах у организмов одного и того же вида также различна. У дрозофилы средняя частота мутаций на ген равна 1х10^-5. Это значит одна новая мутация появляется на 100 тысяч гамет. У человека большинство генов мутирует с частотой от 1х10^-5 до 1х10^-6. Например, ген гемофилии мутирует с частотой 3х10^-5. Это означает 3 новых мутации на 100 тысяч гамет. Однако обнаружены гены, которые в естественных условиях мутируют часто. Такие гены получили название высоко мутабельных (1х10^-4 изменений на локус, на поколение). Для наиболее устойчивых участков генома человека частота мутаций 1х10^-11. Однако следует отметить, что в целом спонтанные генные мутации представляют собой редкие случайные события.

Генные мутации - это обратимый процесс. Все дело в том, что нормальные особенности организмов вида, созданные в процессе эволюции, как правило, определяются доминантными генами (аллелями), наиболее распространенными в природе. Они получили название нормальных аллелей или генов «дикого типа». Мутационный процесс, идущий в нормальных особях, превращает доминантные нормальные аллели (гены «дикого типа») в мутантные - рецессивные. Изменения нормальных аллелей (генов «дикого типа») в мутантные называют прямыми мутациями (А→а), превращение мутантных рецессивных аллелей в нормальные доминантные называют обратными мутациями (а→А). Частота мутирования в прямом направлении (А→а), как правило, выше, чем частота обратных мутаций (а→А).

Как отмечалось ранее, мутации могут быть в соматических и половых клетках. Появление соматических мутаций может оказать большое влияние на жизнь особи. У взрослого человека число соматических клеток равно примерно 10¹⁴. Если мы примем, что ген мутирует с невысокой частотой 1х10^-8, то в этом случае в организме человека должно содержаться более миллиона мутантных клеток только по данному гену. Если считать, что у человека около 25 тысяч генов, кодирующих белки, то огромная популяция клеток тела человека только по этим генам испытывает на себе постоянное действие мутаций.

Основной категорией мутаций следует признать мутации в половых клетках (герминальные мутации), поскольку они переходят в следующие поколения организмов и вступают в сложные рекомбинации в условиях полового размножения. У видов, размножающихся половым путем, потомству передаются лишь мутации, которые появляются в половых клетках. Вновь возникший от мутаций рецессивный аллель передается в гетерозиготной форме на протяжении многих поколений, пока скрещивание таких гетерозигот не даст гомозиготное потомство. У такого потомка мутантный аллель будет проявляться в фенотипе.

Мутационный процесс имеет место у всех организмов. Много мутаций обнаружено у дрозофилы. Например, желтое тело - рецессивная мутация, аллель расположен в Х-хромосоме; бескрылая форма - рецессивная мутация, мутантный аллель находится во II хромосоме. Большое количество генных мутаций открыто у человека. Они касаются его морфологии, биохимии, склонностей поведения, умственных способностей и т.д. Большинство наследственных заболеваний и другие отклонения от нормы в конечном счете - следствие генных мутаций.

Лекция 11

Индуцированный мутагенез. Репарация генетического материала. Механизмы репарации ДНК. Понятие о генных болезнях.

В прошлой лекции шла речь главным образом о спонтанных (естественных) генных мутациях. Однако мутации могут быть индуцированными, возникать под действием ряда искусственных мутагенных факторов. Природа мутагенных факторов разнообразна, но в общем они делятся на физические, химические и биологические мутагенные факторы. По механизму возникающих изменений в генетическом материале между спонтанным и индуцированным мутагенезом принципиальных различий нет. Все факторы индуцированного мутагенеза будь они физическими, химическими или биологическими в конечном итоге нарушают молекулярную структуру отдельных генов, вызывают нарушения последовательности нуклеотидов с вытекающими отсюда последствиями.

Мутагенное действие физических факторов

К физическим мутагенным факторам относятся ионизирующее и ультрафиолетовое излучение. К ионизирующему излучению относятся электромагнитные колебания (рентгеновское и гамма-излучение) и потоки частиц (протоны, нейтроны, альфа-частицы и др.). Их энергия, проходя через клетку, вырывает электроны из внешней оболочки атомов или молекул, превращая их в нестабильные свободные радикалы и ионы. Свободные радикалы и ионы вступают в разнообразные химические реакции, что прямо или косвенно затрагивает азотистые основания в структуре ДНК и приводит к точечным мутациям. Мутагенный эффект ионизирующего излучения может быть связан с радиолизом воды в клетке. При этом образуются генотоксические радикалы и молекулы: гидроксильный радикал; супероксидный радикал^.; перекись водорода. В тех случаях, когда энергия ионизирующих излучений поглощается непосредственно молекулами ДНК, прямо вызывая в них первичные повреждения, имеет место прямое воздействие радиации на генетический аппарат.

Один из видов электромагнитных колебаний является ультрафиолетовое излучение. В отличие от ионизирующего излучения ультрафиолетовое облучение обладает малой энергией и не способно вызывать ионизацию. Под действием ультрафиолетовых лучей в молекуле ДНК образуются пиримидиновые димеры (димеризация пиримидинов), обычно между остатками тимина, находящимися рядом в одной из цепей (рис. 2). Реже встречаются димеры между остатками цитозина, либо тимина и цитозина. Это следует рассматривать как предмутационное повреждение. Димеры нарушают спиральную конформацию ДНК и ингибируют нормальную репликацию, а это приводит к появлению ошибок репликации и развитию мутаций.

Рис. 2. Образование пиримидиновых димеров

Мутагенным действием обладает высокая температура. Мутагенный эффект повышенной температуры связан с ускорением процессов спонтанного мутирования. Это обеспечивает количественно небольшое влияние повышенной температуры на процессы мутаций. Уровень естественного мутирования повыщается в 2-3 раза при увеличении температуры на 10^оС.

Мутагенное действие химических соединений

В настоящее время обнаружены сотни химических веществ, обладающих мутагенной активностью. Они имеются во всех классах химических соединений. Многие из них мутагенные в отношении как реплицирующейся, так и нереплицирующейся (покоящейся) ДНК: алкилирующие соединения, азотистая кислота. Однако есть мутагенные вещества, действующие на ДНК только в течение ее синтеза.

Обширная группа сильных химических мутагенов принадлежит к алкилирующим соединениям. Химически они являются источником введения в молекулы ДНК таких радикалов как метил (СН₃-) - реакция метилирования ДНК, этил (С₂Н₅-) - реакция этилирования ДНК и другие. В качестве хорошо изученных мутагенов этой группы используют этиленимин, иприт, диэтилсульфат, нитрозоэтилмочевину и другие. Некоторые из них получили название супермутагенов за их исключительно высокую способность индуцировать мутации. Главное следствие мутагенного действия алкилирующих агентов – это появление мутаций типа транзиций ГЦ→АТ.