Материал: Kurs_Lektsiy_po_Biologii (1)

Популяционно-статистический метод

Этот метод предназначен для изучения распространения наследственных признаков (в том числе патологических) в популяциях людей в одном или ряду поколений. Особенностью метода является проведение статистической обработки результатов наблюдений. На основании данных, полученных этим методом, рассчитывают частоту встречаемости в исследуемой группе населения различных аллелей гена, разных генотипов по этим аллелям. Метод позволяет также рассчитывать степень гетерозиготности в популяции по определенным аллелям, анализировать влияние факторов среды на экспрессию генов (показатели экспрессивности и пенетрантности). При статистической обработке результатов обследования индивидов той или иной популяции по интересующему исследователей признаку, а также для обоснований особенностей генетического состава популяции используется закон Харди-Вайнберга. Согласно закона Харди-Вайнберга процесс наследственной преемственности при определенных условиях сам по себе не ведет к изменению частот аллелей и частот генотипов по определенному гену в ряду поколений. Такими определенными условиями являются: отсутствие мутаций, отбора, миграции и дрейфа генов. Этот закон утверждает также, что если скрещивание случайно, то частоты генотипов связаны с частотами генов простыми (квадратичными) соотношениями. При случайном скрещивании равновесные частоты генотипов по данному гену достигаются уже за одно поколение, если частоты аллелей одинаковы у обоих полов. Если частоты аллелей у двух полов исходно различны, то равновесные частоты генотипов достигаются за два поколения. Равновесные частоты генотипов определяются (задаются) произведениями частот соответствующих аллелей. Если имеется, например, только два аллеля, А и а с частотой p и q, то частоты трех возможных генотипов выражаются уравнением:

- где буквам во второй строчке, обозначающим аллели и генотипы, соответствуют расположенные над ними частоты в первой строчке.

Если имеется два аллеля, как показано выше, с частотами p и q, то сумма частот этих аллелей равна 1 (p + q = 1), следовательно, сумма частот генотипов тоже будет равна 1 (p² + 2pq + q² = 1). Последнее уравнение представляет математическое выражение закона Харди-Вайнберга. Закон Харди-Вайнберга (его математическое выражение) позволяет рассчитывать частоты генов и генотипов, частоту гетерозигот-носителей скрытого рецессивного (нередко патогенного) аллеля.

Имея данные о частоте встречаемости в популяции рецессивного фенотипа, легко рассчитать частоту встречаемости в генофонде обследуемого поколения рецессивного аллеля. На основании этого можно предсказать появление в последующих поколениях рецессивных гомозигот и гетерозиготных носителей соответствующего рецессивного аллеля.

Методы пренатальной (дородовой) диагностики наследственных болезней

В настоящее время в распоряжении специалистов имеется обширный арсенал как прямых, так и непрямых методов исследования, позволяющих установить врожденные и наследственные заболевания у плода.

Непрямые методы – это обследование беременной женщины. Непрямые методы позволяют выявить женщин, имеющих повышенный риск рождения ребенка с наследственной патологией. Женщины направляются на пренатальную диагностику по следующим показаниям: возраст женщины 35 лет и старше; повторные спонтанные прерывания беременности; рождение ребенка с врожденными пороками развития; являющихся носителями хромосомных перестроек; инфекции у беременной; воздействие тератогенного фактора (радиация, химические вещества).

К непрямым методам относятся: акушерско-гинекологическое; генеалогическое; бактериологическое; цитогенетическое; иммунологическое обследование; биохимические методы.

При использовании непрямых методов о состоянии плода важное значение имеет определение в сыворотке крови беременной веществ, получивших название маркеров матери: концентрации α-фетопротеина (АФП); уровня хорионического гонадотропина (ХГЧ); уровня неконьюгированного (несвязанного) эстриола (НЭ).

Хорошим биохимическим маркером состояния плода оказался α-фетопротеин. Это белок, который вырабатывается печенью плода во внутриутробном развитии. Содержание АФП значительно возрастает в крови беременной при открытых дефектах невральной трубки, нарушениях целостности брюшной стенки и других дефектах развития плода. При некоторых хромосомных болезнях плода, в частности при болезни Дауна, уровень α-фетопротеина в крови беременной женщины часто снижен. Указанный тест наиболее информативен на 16-18 неделе беременности.

Диагностическую ценность для выявления синдрома Дауна у плода представляет определение в крови беременной уровня гормонов: β-субъединицы хорионического гонадотропного и неконьюгированного эстриола. При вынашивании плода с синдромом Дауна в крови беременной повышен уровень ХГЧ и снижено содержание эстриола.

В случае обнаружения измененного уровня АФП, ХГЧ и эстриола в крови беременной женщины она направляется на дополнительное исследование.

Прямые методы – непосредственное исследование состояния плода. К ним относятся неинвазионные и инвазионные методы. Неинвазионные методы – это обследование плода без оперативного вмешательства. Наиболее распространенный из неинвазивных методов является ультразвуковое исследование плода (УЗИ). УЗИ позволяет выявить как врожденные пороки развития, так и функциональное состояние плода и его провизорных органов (плаценты, пуповины, оболочек). Обязательные сроки проведения УЗИ - это 10-13, 20-22 и 30-32 неделя беременности.

Практически все неинвазивные методы как прямые, так и непрямые, позволяют только выявить женщин с высоким риском рождения детей с наследственными болезнями, которым показана пренатальная диагностика состояния плода с применением инвазивных методов исследования. Установить окончательный диагноз и определить тактику ведения беременности можно только после исследования плодного материала. Все процедуры инвазивной диагностики во время беременности несут определенный риск и производятся под контролем УЗИ.

К инвазивным методам относятся: амниоцентез (получение амниотической жидкости); биопсия хориона (взятие образцов ворсин хориона); кордоцентез (взятие крови плода из пуповины); биопсия тканей плода (кожа, мышцы и др.).

Амниоцентез – прокол амниотического (плодного) пузыря с целью получения околоплодной (амниотической) жидкости, проводится на 15-20-й неделе беременности. Амниоцентез делают через переднюю брюшную стенку матери под контролем УЗИ. Из амниотической полости извлекают10-30 мл амниотической жидкости. Амниотическую жидкость центрифугируют, получают осадок клеток и надосадочную жидкость. Из показателей надосадочной жидкости только концентрация АФП является диагностически значимой (см.выше). Основным источником диагностического материала при амниоцентезе являются клетки. Эмбриональные клетки происходят из амниона плода, эмбриональной кожи, желудочно-кишечного тракта. Клетки обязательно культивируют в питательной среде в течение 2-3 недель для получения достаточного количества клеток с целью проведения картирования или анализа ДНК. Для идентификации числовых изменений хромосом используют цитогенетические методы. Культуру амниотических клеток используют и для биохимического анализа, ДНК-диагностики.

Биопсия хориона применяется для получения небольшого количества ворсин хориона в период с 7-й по 16-ю неделю беременности. Процедура сбора ворсин выполняется через шейку матки (трансцервикально) или через переднюю брюшную стенку (трансабдоминально) под контролем УЗИ. Взятие образцов через брюшную стенку предпочтительнее, поскольку меньше риск внесения инфекции. Ворсины хориона являются производными эмбриональной трофобластной ткани и могут использоваться для цитогенетического анализа, ДНК-диагностики и биохимического анализа. Биопсия хориона имеет физиологическое и практическое преимущество по сравнению с амниоцентезом, который проводят не ранее 15-й недели. Кроме того цитогенетические результаты при биопсии хориона можно получить быстрее, поскольку в ворсинах хориона имеются делящиеся клетки. Однако хромосомный анализ при биопсии хориона менее надежен и риск выкидыша после биопсии ворсин хориона выше, чем после амниоцентеза.

Кордоцентез – взятие крови из пуповины с целью выявления возможных аномалий плода. Процедуру осуществляют с 20-й недели беременности под контролем УЗИ. Прокол делают через переднюю брюшную стенку матери. Образцы крови являются объектом для цитогенетических, молекулярно-генетических и биохимических методов диагностики наследственных болезней. Кордоцентез обычно делают в тех случаях когда информацию, необходимую для диагностики, нельзя получить с помощью амниоцентеза, биопсии хориона или когда получены подозрительные результаты. Преимущество кордоцентеза по сравнению с амниоцентезом заключается в том, что кровь является более удобным объектом для исследования, чем клетки амниотической жидкости. Лимфоциты крови культивируются быстрее (2-3 дня) и они надежнее, чем амниоциты.

Биопсия тканей плода осуществляется после 12 недели беременности под контролем УЗИ. Используется для диагностики целого ряда наследственных заболеваний. Например, для диагностики наследственных болезней кожи (ихтиоз, эпидермолиз) делают биопсию кожи плода. Затем проводят патоморфологическое исследование и по морфологическим критериям исследования болезней кожи ставят точный диагноз или отвергают его.

Лекция 15

Индивидуальное развитие организма (онтогенез). Периодизация онтогенеза. Предэмбриональный и эмбриональный периоды развития.

Индивидуальное развитие организма - это совокупность процессов, которые обеспечивают возникновение и динамику развития организма во времени. Индивидуальное развитие понятие широкое, которое в настоящее время сформировалось в отдельную область науки о живом – биологию развития, изучающую закономерности онтогенетического развития организма. Биология развития сформировалась путем синтеза ряда биологических дисциплин: эмбриологии, генетики, молекулярной биологии, цитологии, биохимии. В настоящее время биология развития изучает закономерности онтогенеза на молекулярном, генетическом, клеточном, тканевом, органном и организменном уровнях. На сегодняшний день наши знания все еще ограничены о закономерностях индивидуального развития. Например, не существует достаточно аргументированных теорий, которые могли бы объяснить каким образом закодирована и как реализуется информация об особенностях пространственного строения органов высших организмов. Какой таинственный механизм заставляет принять организм именно ту форму, которая свойственна данному виду, причем с поразительной точностью. Единственное, что не вызывает сомнения, это то, что основу процесса развития составляет наследственная информация, полученная потомками от родителей через половые клетки. И развитие в этой связи надо рассматривать как процесс реализации генетической информации.

Прежде чем давать характеристику индивидуального развития необходимо отметить, что развитие организмов может быть личиночное (непрямое) и прямое. Личиночное развитие характеризуется тем, что в развитии организма имеется одна или несколько личиночных стадий. Личинки ведут активный образ жизни, сами добывают пищу. У личинок имеется временные (провизорные) органы с помощью которых осуществляются жизненные функции личинок. У взрослого организма эти органы отсутствуют. В дальнейшем происходит метаморфоз – превращение личинки во взрослый организм. При прямом развитии из оплодотворенной яйцеклетки происходит постепенное развитие взрослого организма. При этом также имеют место на определенных этапах провизорные (зародышевые) органы, которые функционируют у зародыша и отсутствуют во взрослом состоянии. У млекопитающих и человека к ним относятся зародышевые оболочки (хорион, амнион, желточный мешок, аллантоис), а также плацента.

Индивидуальное развитие организма представляет непрерывный процесс развития. Однако в нем выделяют отдельные периоды и стадии в зависимости от смены преобладающих молекулярных, клеточных и системных механизмов, а также от характера взаимоотношений организма с внешней средой. Во-первых, выделяют три периода: предэмбриональный (предзародышевый); эмбриональный и постэмбриональный. Предэмбриональный период – это период развития половых клеток. Эмбриональный период – это период от оплодотворения яйцеклетки и образования зиготы до момента рождения, что касается млекопитающих и человека, или выхода из яйцевых и защитных оболочек, что касается других организмов. Постэмриональный период – это период с момента появления на свет до естественной гибели организма.

Предэмбриональный период. Это период развития половых клеток (гаметогенез). Этот процесс мы подробно рассматривали ранее. Тем не менее, следует назвать отдельные этапы развития половых клеток: 1) обособление первичных половых клеток от других (соматических) клеток организма; 2) размножение половых клеток, называемых на этой стадии гаметогониями; 3) рост половых клеток; 4) созревание половых клеток (мейоз); 5) формирование.

Необходимо отметить некоторые особенности развития яйцеклеток, которые связаны с обеспечением ранних этапов развития зародыша. Одной из таких особенностей овогенеза является интенсивное накопление огромного запаса компонентов аппарата трансляции (биосинтеза белка). У многих животных в ооците в короткие сроки накапливается огромное количество рибосом. Этому способствует умножение или амплификация генов рибосомных РНК яйцеклетки. При обычной репликации ДНК удваивается вся ДНК хромосомы, тогда как при амплификации копируются только избранные участки, в данном случае участки ДНК, где находятся гены рибосомных РНК. Копии ДНК отделяются от хромосомы, в результате формируются большое число дополнительных ядрышек, которые интенсивно продуцируют рибосомы. Кроме того, при овогенезе накапливаются тРНК, интенсивно синтезируются и депонируются иРНК. Таким образом, в яйцеклетке запасаются все компоненты, необходимые для синтеза белка, которые будут использоваться на ранних стадиях развития эмбриона. Вторая особенность овогенеза – образование и накопление в цитоплазме яйцеклетки питательных веществ (желток, углеводы, жиры, липиды, витамины, минеральные соли), которые используются также на ранних стадиях развития зародыша. Основную массу желтка составляют белки. В состав желтка, накапливаемого в овогенезе, входит примерно 90% всего белка клетки.

Для яйцеклетки характерна ооплазматическая сегрегация. Непосредственно перед оплодотворением начинаются и продолжаются после оплодотворения в зиготе интенсивные перемещения составных частей (компонентов) цитоплазмы яйцеклетки разного химического состава. Это явление получило название ооплазматическая сегрегация. Эти процессы создают определенную пространственную организацию будущего зародыша и определяют начальные этапы его дифференцировки, о чем будет говориться ниже.

Эмбриональный период. В эмбриональном периоде выделяют ряд отдельных стадий: 1) стадия оплодотворения; 2) стадия зиготы; 3) стадия дробления (образование однослойного зародыша); 4) стадия гаструляции (образование двух- и трехслойного зародыша); 5) стадия гисто-, органогенеза).

Стадия оплодотворения. Оплодотворение – это процесс слияния половых клеток. Выделяют наружное и внутреннее оплодотворение. У большинства животных, обитающих в воде, гаметы выделяются наружу и оплодотворение происходит вне тела матери. У животных, ведущих наземный образ жизни, семенная жидкость вводится в организм самки во время полового акта. Там и происходит оплодотворение. Однако процесс оплодотворения весьма сложный, включает ряд фаз и сопровождается выраженными изменениями в яйцеклетке и сперматозоиде. В процессе оплодотворения можно выделить три фазы: 1) сближение гамет; 2) активация гамет; 3) слияние гамет (сингамия). Сближение гамет сводится к дистантному взаимодействию между яйцеклеткой и сперматозоидом. Первоначально предполагали, что движение сперматозоида к яйцу носит целенаправленный характер и происходит благодаря хемотаксису. Предположение о хемотаксическом механизме сближения не подтвердилось , за исключением отдельных случаев, описанных у некоторых видов гидромедуз и высших споровых растений. На самом деле сближение сперматозоида с яйцом обеспечивается совокупностью ряда неспецифических факторов, повышающих вероятность их столкновения: 1) координирование процессов гаметогенеза у самца и самки и одновременность наступления стадии готовности к оплодотворению; 2) приспособления, связанные с оплодотворением и совокуплением, которые обеспечивают попадание созревших половых клеток в места, где происходит процесс оплодотворения; 3) избыточная продукция сперматозоидов по сравнению с числом женских половых клеток; 4) крупные размеры яйца, способствующие повышению вероятности столкновения со сперматозоидом. Не исключено, что существуют и другие факторы, однако и перечисленных достаточно, чтобы обеспечить оплодотворение всех созревших яиц животного. Кроме того, яйцеклетки и сперматозоиды вырабатывают химические вещества, которые возможно участвуют в обеспечении их сближения и взаимодействия. Эти вещества были названы гамоны.

Активация гамет начинается после соприкосновения сперматозоида и яйцеклетки. Процесс активации сперматозоида называется – акросомная реакция, яйцеклетки – кортикальная реакция. Принципы оплодотворения примерно одни и те же у разных видов животных. Но есть некоторые особенности у разных видов, которые, в частности, зависят от строения оболочек яйца. Нас конечно интересуют млекопитающие и человек. У млекопитающих и человека сперматозоид должен преодолеть несколько слоев фолликулярных клеток, блестящую оболочку и плазматическую мембрану яйцеклетки. Когда сперматозоид соприкасается с поверхностью яйца он активируется (акросомная реакция): в области акросомы сперматозоида разрушается плазматическая мембрана, из сперматозоида выходят гидролитические ферменты (сперматолизины), которые разрушают контакты между фолликулярными клетками, блестящую оболочку и сперматозоид достигает плазматической мембраны яйца. В месте контакта плазматическая мембрана яйца разрушается, плазматические мембраны сперматозоида и яйцеклетки сливаются и сперматозоид оказывается внутри яйцеклетки.

При соприкосновении сперматозоида и яйца активируется и яйцеклетка (кортикальная реакция). При кортикальной реакции повышается в яйце содержание ионов кальция, что сопровождается активированием биохимических процессов в клетке. Надо иметь в виду, что при оплодотворении сперматозоид прикрепляется в определенном месте блестящей оболочки, в том месте, где имеется специфический рецептор к сперматозоиду, который синтезируется яйцом. Только после фиксации сперматозоида на этом рецепторе он проникает через блестящую оболочку, плазматическую мембрану и попадает внутрь яйцеклетки, завершая процесс оплодотворения. Затем рецептор изменяется и тем самым создается препятствие для фиксации и проникновения внутрь других сперматозоидов. Это препятствует полиспермии у млекопитающих и человека. У ряда животных, в частности в яйцеклетках морского ежа, полиспермии препятствует изменение электрического потенциала плазматической мембраны яйца, а также формирование оболочки оплодотворения после проникновения одного сперматозоида.