химическим методом – при изучении нативных (сохранивших естественную
структуру) препаратов от больного (кровь, ликвор, гной и т.д.). В качестве химических фиксаторов чаще используют этиловый и метиловый спирт, а также смесь Никифорова (смесь этилового спирта и эфира в соотношении 1:1).
Цель фиксации:
убить микроорганизмы;
прикрепить их к предметному стеклу;
улучшить их прокрашивание.
СВЕТОВОЙ МИКРОСКОП. Разрешающая способность 0,2 мкм.
Предназначен для изучения формы, размеров и структуры окрашенных клеток.
При исследовании микроорганизмов применяют иммерсионный объектив. Его преимущество – с помощью иммерсионного масла устанавливается оптически однородная среда с одинаковым показателем преломления между стеклом и линзой. Благодаря этому все лучи, не преломляясь и не изменяя направления, попадают в объектив, чем достигается более высокая разрешающая способность. В качестве иммерсионного масла обычно используют кедровое или касторовое, показатель преломления которых равен показателю преломления света в стекле.
ТЕМНОПОЛЕВОЙ МИКРОСКОП (ультрамикроскоп). Разрешающая способность – 0,02-0,04 мкм.
Предназначен для изучения формы, размеров и подвижности живых, неокрашенных бактерий.
Темное поле создается с помощью специального конденсора, в котором затемнена центральная часть и таким образом создается боковое освещение. Поэтому в объектив попадают лучи, отраженные от объекта. Увеличение разрешающей способности микроскопа связано с тем, что отраженный луч имеет более короткую длину волны.
ФАЗОВО-КОНТРАСТНЫЙ МИКРОСКОП. Разрешающая способность – 0,2 мкм.
Предназначен для изучения формы, подвижности и структуры живых неокрашенных бактерий.
Имеет специальный набор фазовых объективов и соответствующих им кольцевых диафрагм конденсора. С помощью этого устройства достигается преобразование невидимых фазовых колебаний преломленного луча в видимые амплитудные колебания.
ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МИКРОСКОП. Разрешающая способность – 0,2 мкм.
Предназначен для экспресс-диагностики вирусных и бактериальных инфекций.
Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ светиться под действием коротковолновых ультрафиолетовых (УФ) лучей. Препараты для люминесцентной микроскопии окрашивают специальными люминесцентными красителями – флуорохромами (акридиновый оранжевый, аурамин и др.). В качестве источника УФ-света обычно используют ртутнокварцевую лампу. Под действием УФ-излучения окрашенные клетки начинают светиться красным или зеленым светом.
ЭЛЕКТРОННЫЙ МИКРОСКОП. Разрешающая способность – менее 1Å (Å – ангстрем).
Предназначен для изучения строения вирусов, бактерий и отдельных макромолекул.
Высокая разрешающая способность достигается малой длиной волны электронов. В электронном микроскопе вместо света используют поток электронов в безвоздушной среде. Источником электронов является вольфрамовая нить катода, разогреваемая до высокой (2500-29000С) температуры. Роль оптических линз выполняют электромагниты. Для исследования препаратов в электронном микроскопе применяют специальные пленки, проницаемые для электронов.
7. Окраска по Граму. Механизм окраски. Примеры грамположительных и грамотрицательных бактерий.
Окраска по Граму (в модификации Синѐва):
на фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу, пропитанную генциан-фиолетовым, смачивают водой, окрашивают 2 минуты;
снимают бумагу и наносят на мазок раствор Люголя на 1 минуту, затем краситель сливают;
обесцвечивают мазок 96о спиртом 10-15 секунд;
промывают мазок водой;
докрашивают мазок фуксином Пфейффера 30 секунд;
промывают мазок водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.
Механизм окраски по Граму.
Дифференцировка на грамположительные и грамотрицательные бактерии зависит от строения клеточной стенки, основой которой является пептидогликан. У грамположительных бактерий толщина пептидогликана 500Å, у грамотрицательных – не более 150Å.
При окрашивании препарата генциан-фиолетовым, а затем раствором Люголя, образуется комплекс генциан-фиолетовый + йод. Все клетки окрашиваются в сине-фиолетовый цвет. При обработке спиртом у грамположительных бактерий образовавшийся комплекс не обесцвечивается. Поэтому при окрашивании фуксином Пфейффера они сохраняют сине-фиолетовый цвет. У грамотрицательных бактерий комплекс генциан-фиолетовый + йод обесцвечивается спиртом и при окраске фуксином Пфейффера они приобретают розово-красный цвет.
В результате окраски бактерии дифференцируют на грамположительные (сине-фиолетовые) или грамотрицательные (розово-красные).
К грамположительным относят все кокки (кроме нейссерий) и спорообразующие бактерии. К грамотрицательным – нейссерии, неспорообразующие бактерии, спириллы.
К оболочечным структурам бактериальной клетки относят капсульный слой, клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану.
Снаружи многие бактерии имеют КАПСУЛЬНЫЙ СЛОЙ (МИКРОКАПСУЛУ). Это слизистое образование, не превышающее диаметр бактериальной клетки. У некоторых бактерий имеется ИСТИННАЯ КАПСУЛА – слизистый слой, превышающий диаметр бактериальной клетки. Капсула не является обязательной структурой. У большинства бактерий она имеет полисахаридную природу. У некоторых (Bacillus anthracis) – состоит из белка.
Большинство бактерий образуют капсулу только в макроорганизме
(in vivo): Streptococcus pneumoniaе – возбудитель крупозной пневмонии;
Bacillus anthracis – возбудитель сибирской язвы;
Clostridium perfringens – возбудитель газовой гангрены;
Francisella tularensis – возбудитель туляремии;
Yersinia pestis – возбудитель чумы.
Некоторые бактерии образуют капсулу в макроорганизме и на питательной среде (in vivo и in vitro):
Klebsiella pneumoniaе – возбудитель пневмонии;
Klebsiella oxytoca– возбудитель сепсиса, инфекций мочевыводящих путей; Klebsiella granulomatis – возбудитель паховой гранулемы.
Функции капсулы:
в макроорганизме защищает бактерии от фагоцитоза и действия антител;
во внешней среде предохраняет бактерии от высыхания.
Капсулу выявляют в окраске по Бурри-Гинсу. В результате окраски бактерии красного цвета, вокруг них бесцветные капсулы на черно-розовом фоне.
КЛЕТОЧНАЯ СТЕНКА представляет собой биополимер – пептидогликан (муреин), являющийся плотной структурой. По строению клеточной стенки грамположительные и грамотрицательные бактерии существенно отличаются друг от друга (см. занятие №2).
Функции клеточной стенки:
придает клетке постоянную форму;
защищает клетку от механических повреждений извне и выдерживает значительное внутреннее давление;
участвует в транспорте метаболитов;
несет на своей поверхности рецепторы для бактериофагов (вирусов бактерий) и различных химических веществ.
L-формы бактерий, их медицинское значение.
L-формы (от названия Института им. Д. Листера, где они впервые были изучены) – это бактерии, полностью или частично лишенные клеточной стенки, но способные к размножению. Имеют своеобразную морфологию в виде крупных и мелких сферических клеток.
L-трансформации могут подвергаться все бактерии, имеющие клеточную стенку.
L-трансформация происходит под действием различных индуцирующих факторов (антибиотики, угнетающие биосинтез клеточной стенки, лизоцим и др.). В результате бактерии становятся устойчивыми к некоторым антибиотикам.
L-трансформация может быть обратимой и необратимой. Обратимая – наблюдается при сохранении генетического контроля синтеза клеточной стенки и тогда бактерии реверсируют в исходную форму.
L-формы могут образовывать многие возбудители инфекционных заболеваний. Это одна из причин хронизации заболеваний и форм приспособления бактерий к неблагоприятным условиям существования.
ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ МЕМБРАНА (ЦПМ) располагается под клеточной стенкой. Представляет собой трехслойную мембрану. Состоит из двойного слоя липидов и белков, пронизывающих липидные слои.
Функции ЦПМ:
является основным осмотическим и онкотическим барьером;
участвует в энергетическом метаболизме и активном транспорте питательных веществ в клетку, т.к. является местом локализации пермеаз и ферментов окислительного фосфорилирования;
участвует в процессах дыхания и деления;
участвует в синтезе компонентов клеточной стенки (пептидогликана); - участвует в выделении из клетки токсинов и ферментов.
ЦПМ выявляется при электронной микроскопии.