Амперометрические иммуноферментные сенсоры в определении антигенов Fusarium oxysporum
Р.М. Бейлинсон, Э.П. Медянцева
Е.А. Кириллова,
Е.В. Халдеева, Г.К. Будников
Аннотация
Предложены иммуноферментные сенсоры (ИФС) с L-цистеиндесульфгидразой (ЦДГ) в качестве метки на основе планарных графитовых электродов для определения антигена (Аг) Fusarium oxysporum. Действие ИФС основано на сочетании иммунологической, ферментативной и электрохимической реакциий. Разработанные иммуносенсоры позволяют определять Аг Fusarium oxysporum в диапазоне концентраций от 5 10-10 - 5-10-6 мг/мл с нижней границей определяемых содержаний 1 10-10 мг/мл. Оценена константа связывания иммунных комплексов Ат-Аг, значение которой составило Ка = (6.2 ± 0.2) Ш9 (мг/мл)-1. Подтверждено отсутствие перекрестного реагирования с Аг патогенных грибов Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger. Методика определения Аг Fusarium oxysporumс с помощью предлагаемого ЦДГ-иммуносенсора апробирована на примере оценки качества пшеничной крупы.
Ключевые слова: Fusarium oxysporum, иммуноферментный сенсор, L-цистеиндесульфгидраза, грибковые патогены
Введение
Грибковые заболевания растений имеют большое экономическое значение, вызывая 70-80% потерь урожая, связанных с микробными патогенами растений. Грибы рода Fusarium являются широко распространенными фитопатогенами, источниками опасных токсинов, наносящими существенный ущерб сельскому хозяйству и производству продуктов питания.
Известно, что Fusarium oxysporum является важным почвенным фитопатогеном. Он отвечает по меньшей мере за 20 различных заболеваний, встречающихся более чем у 120 видов растений. Кукуруза, пшеница, соя и ячмень наиболее часто поражены этим грибковым патогеном. Он проникает в проводящие воду капилляры растений и способствует увяданию, что приводит к преждевременной гибели растения [1].
Традиционные методы определения патогенных грибов основаны на культивировании и морфологических исследованиях, анализе ДНК. Главным образом используют различные варианты полимеразной цепной реакции (ПЦР) [2-6], среди которых самый распространенный - ПЦР в режиме реального времени [7-11], и методы петлевой изотермической амплификации [12-15]. Хотя традиционные методы обладают необходимой специфичностью и чувствительностью, они требуют относительно сложной последовательности стадий, длительны и трудоемки, что не позволяет широко использовать их в целях решения проблем сельского хозяйства и пищевой промышленности.
Спектральные методы оказались альтернативными методам мокрой химии для эффективного и неразрушающего определения грибкового загрязнения в пищевых продуктах [16-22], однако остаются проблемы анализа, связанные с неоднородным распределением токсинов, фоновыми составляющими интерференции, робастностью, разработкой аппаратуры [23]. Хроматографические методы позволяют определять характерные маркерные соединения, включая микотоксины и другие грибковые метаболиты, и таким образом идентифицировать некоторые виды грибков [1, 24-26], однако они ограничены в своем применении. Имеются данные о разработке оптических и электрохимических ДНК -сенсоров с использованием различных подходов для определения некоторых патогенных грибов [27-29]. Кроме того, разработаны тест-системы для быстрого обнаружения грибковых инфекций, основанные на иммунохимических и гибридизационных взаимодействиях ДНК [30-32].
Нами ранее был разработан амперометрический иммуноферментный сенсор (ИФС) с иммобилизованной холинэстеразой (ХЭ) и антителами для определения антигена (Аг) патогенных грибов Trichophyton rubrum. Иммуносенсор основан на специфической иммунореакции Аг с антителами, которые были иммобилизованы вместе с ферментом ХЭ на нитроцеллюлозной мембране. Разработанный иммуносенсор позволяет определять до 1 * 10-15 мг/мл Trichophyton rubrum. Общее время иммуноанализа менее 20 мин. Метод был применен для определения Аг Trichophyton rubrum в сыворотке крови человека [33].
Для растений характерно бессимптомное протекание ранних стадий болезней, вызванных инфицированием грибковыми патогенами. Раннее обнаружение патогенов растений играет важную роль в мониторинге их здоровья. Это позволяет управлять болезнетворными инфекциями на различных этапах их развития, а также минимизировать риск распространения инфекций, что особенно важно при контроле семенного фонда. Поэтому имеет особое значение разработка экспрессных методов анализа для контроля поступающей сельскохозяйственной продукции и анализа на всех этапах производства продуктов питания. Разработка селективных и высокочувствительных иммуносенсоров является перспективным решением подобного рода задач.
В связи с этим цель настоящей работы - оценить возможность использования ЦДГ в качестве метки при создании иммуносенсоров на основе планарных электродов, модифицированных наноструктурированными материалами, для определения Аг F. oxysporum и контроля его содержания в сельскохозяйственных продуктах.
1. Экспериментальная часть
Основой разработанного иммуносенсора служила система, состоящая из рабочего, вспомогательного электродов и электрода сравнения, полученная на полимерной подложке методом печатных технологий конструкции «3 в 1» (получены на кафедре аналитической химии КФУ, Казань, Россия). Материалом поверхности рабочего электрода, на которой иммобилизуются модификатор и фермент, являются графитовые чернила (GwentElectronicMaterials, США). Вспомогательный электрод изготовлен также из графитовых чернил. Электрод сравнения - паста AgCl/Ag.
Объем рабочей ячейки системы составлял 1.8 мл. Все измерения с использованием этих электродов проводили с помощью потенциостата/гальваностата Autolab PGSTAT204 (Metrohm Autolab, Нидерланды). Электрохимическую стабилизацию и очистку поверхности электрода проводили путем циклического изменения потенциала в диапазоне потенциалов от 0 до 1000 мВ, для этого регистрировали 6-7 циклических вольтамперограмм в растворе насыщенного КС1 при скорости развертки 100 мВ/с.
Использовали фосфатный буферный (ФБ) раствор (рН 7.60 ± 0.05). Значения рН водных растворов определяли рН-метром «Эксперт 001» со стеклянным электродом, градуированным по стандартным буферным растворам.
В качестве субстратов использовали L-цистеин (Sigma), растворы которого готовили по точной навеске в рабочем буферном растворе. В качестве источника ЦДГ использовали гомогенат из проростков зерновых культур (овса), в качестве консерванта - 0.5 М сахарозу. Применяли 25%-ный раствор глутарового альдегида фирмы ICN (Biomedicals Inc., США), аминопроизводное гиперразветвленного полиэфира полиола Boltorn-H20-NH2 (получен на кафедре неорганической химии КФУ, Казань, Россия) [34].
В настоящей работе использовали Аг Fusarium oxysporum, Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger и сыворотку поликлональных Ат против Fusarium oxysporum (полученные и предоставленные лабораторией микологии Казанского НИИ эпидемиологии и микробиологии (КНИИЭМ) (Казань, Россия)). Концентрации водных растворов Ат и Аг были определены спектрофотометрически при X 280 и 266 нм соответственно с помощью прибора BioSpectrometer (Eppendorf, Германия) при температуре 25 °С. Концентрация Ат против Аг F. oxysporum в разведении 1:20 - 4.8 мг/мл. Начальные концентрации Аг грибов Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Cladosporium herbarum, Alternaria alternata составили 5.5, 2.4, 2.5, 1.5, 11.3 мг/мл соответственно.
Получение гомогената из проростков овса. Для приготовления гомогената растительный материал (проростки овса) мелко нарезали и растирали пестиком в вымороженной ступке, заливали 0.1 М ФБ рН 7.6 в соотношении 1:3, процеживали суспензию через двойной марлевый слой и добавляли 0.5 М раствор сахарозы. Полученный гомогенат использовали для получения биочувствительного слоя иммуносенсоров [35].
Получение Аг F. oxysporum. Антиген F. oxysporum получен по оригинальной методике (КНИИЭМ). Получение основано на экстракции биоактивных компонентов из биомассы гриба 0.85%-м раствором NaCl с последующим удалением микотоксинов путем экстракции хлороформом. Затем экстракт фракционировали этанолом. Для стабилизации использовали стерилизующую фильтрацию через керамические фильтры. Культивирование биомассы проводили на среде Чапека. Полученную биомассу промывали, центрифугировали и обезжиривали ацетоном.
Готовые антигены тестировали на токсичность, аллергенную активность, активность в иммунологических реакциях (иммунодиффузия с кроличьими антисыворотками).
Изготовление амперометрических иммуносенсоров на основе иммобилизованного фермента ЦДГ. Для получения биочувствительной части ИФС на поверхность рабочего электрода наносили смесь, содержащую раствор фермента (ЦДГ), раствор Ат против Аг F. oxysporum (1:20), раствор Boltom-H20-NH2, рабочий буфер (pH 7.6), дистиллированную воду и 1%-ный раствор глутарового альдегида. Глутаровый альдегид вносили в последнюю очередь и после перемешивания на поверхность электродов наносили по 1 мкл этой смеси. Полученные таким образом иммуносенсоры оставляли на ночь в закрытой чашке Петри при температуре +4 °С. В дальнейшем хранили в холодильнике не более 15 сут [35].
Статистическая обработка полученных результатов проведена с использованием пакета прикладных программ Microsoft Office, определены средние величины (М), стандартная ошибка средней массы (m).
1.1 Определение характеристик иммунных комплексов
Определение констант связывания иммунного комплекса антиген - антитело. Константа связывания (константа образования иммунного комплекса) является одной из наиболее важных физико-химических характеристик иммунологической реакции, на основании которой можно сделать вывод о возможности использования данной реакции в аналитических целях, оценить качество иммунореагентов:
где Ка - константа образования иммунного комплекса, k1 и k-1 - константы прямой и обратной иммунологических реакций;
[Аг - Ат] - равновесная концентрация иммунного комплекса, [Аг]
[Ат] - равновесные концентрации антигена и антител соответственно.
Для разработки методов иммуноанализа достаточно знать эффективные значения констант связывания, характеризующие свойства используемых Ат.
Константу Ка определяли, используя зависимость B/F от B (график Скэт- чарда), представляющую собой прямую линию с тангенсом угла наклона, равным Ка, пересекающую ось абсцисс в точке, соответствующей А0 [36]. Ка можно представить в следующем виде:
Ка = B/F(C0 - B),
где F - равновесная концентрация антигена в растворе,
А0 - общая концентрация Ат в системе,
С0 - исходная концентрация антигена,
B/F - отношение концентраций связанного и свободного Аг.
1.2 Определение процента перекрестного реагирования
Процент перекрестных реакций определяли как отношение концентрации основного и мешающего компонентов, полученных как точки пересечения перпендикуляра, восстановленного из значения аналитического сигнала, соответствующего используемой концентрации, деленного на два (ось У) с перпендикулярами, опущенными на ось концентраций (ось Х), используя соответствующие градуировочные графики для их определения.
Процент перекрестных реакций вычисляли как (СУС2)-100%, где С1 и С2 - концентрации основного и мешающего компонентов при 0.5 величины максимального аналитического сигнала [37].
2. Результаты и их обсуждение
Изучение действия Аг F. oxysporum на фермент класса лиаз - ЦДГ - показало, что Аг не является эффектором этого фермента, поэтому были сделаны попытки использования его в качестве меток при создании ИФС для определения Аг грибов.
Разработанный ИФС представляет собой графитовый печатный электрод, на поверхности которого проводили соиммобилизацию фермента и Ат против Аг F. oxysporum (рис. 1).
а б в
Рис. 1. Схема действия ИФС на основе иммобилизованных Ат против Аг Fusarium oxysporum и фермента (Е) включает: совместно иммобилизованные фермент и Ат (а), Аг в растворе (б), образующийся иммунный комплекс и варианты подхода субстрата к активной поверхности фермента (в)
2.1 Природа формирования аналитического сигнала ЦДГ-биосенсора
ЦДГ катализирует разложение L-цистеина с образованием аммиака, пировино- градной кислоты и сероводорода [38]:
Пик окисления L-цистеина на графитовом печатном электроде на фоне ФБ раствора рН 7.6 наблюдается при потенциале 0.45 В (рис. 2). Концентрация субстрата, L-цистеина, составляла 1-10-3 М:
Действие Аг Fusarium oxysporum на ИФС. Установлено, что Аг F. oxysporum оказывает ингибирующее действие на биочувствительную часть иммуносенсоров, что, вероятно, связано с образованием комплекса Ат-Аг, который создает стерические препятствия при подходе субстрата к активному центру фермента. В случае ИФС на основе ЦДГ ингибирующее действие Аг F. Oxysporum наблюдалось в области концентраций 5* 10-10- 5-10-6 мг/мл. Линейная зависимость между логарифмом концентрации и отношением токов описывается уравнением: