Ґ = (-11.6 ± 0.9) - (-lg C) +(127.0 ± 0.9),
где Ґ = 1р/1о-100 (1р - ток в присутствии ингибитора,
1о - ток в отсутствие ингибитора).
Разработанный иммунофермент- ный сенсор позволяет определять концентрации F. oxysporum с нижней границей определяемых содержаний до 1-10-10 мг/мл.
Наибольший ингибирующий эффект наблюдался при использовании Ат в разведении 1:20 (максимальная степень ингибирования (72.3 ± 0.5)%. Разведения Ат 1:10, 1:30, 1:40, 1:50 обеспечивали более низкую величину аналитического сигнала и более низкую степень ингибирования.
Аналитические характеристики ИФС для определения F. oxysporum представлены в табл. 1. Правильность результатов определения Аг F. oxysporum, полученных с использованием разработанных ИФС, подтверждена методом «введено - найдено» (табл. 2).
Рис. 2. Вольтамперограммы электроокисления раствора 1 * 10-3 М цистеина на фоне ФБ раствора рН 7.6 (1), в присутствии ЦДГ (2), в отсутствие ЦДГ (4), в присутствии Аг Fusarium oxysporum и ЦДГ (3) на печатном графитовом электроде
Таблица 1
Определение Аг Fusarium oxysporum с помощью ИФС на основе ЦДГ (п = 3, P = 0.95)
|
Введено, мг/мл |
Найдено, мг/мл |
Ј |
Процент открытия, % |
|
|
3-10-8 |
(2.9 ± 0.2)-10-8 |
0.069 |
94-107 |
|
|
7 * 10-9 |
(7.2 ± 0.3)-10-9 |
0.042 |
96-104 |
Таблица 2
Определение Fusarium oxysporum с помощью ЦДГ-иммуносенсора (п = 3, P = 0.95)
|
Введено, мг/мл |
Найдено, мг/мл |
Процент открытия, % |
||
|
5 * 10-7 |
(4.7 ± 0.2) *10-7 |
0.043 |
96-104 |
|
|
5 * 10-8 |
(5.2 ± 0.3)И0-8 |
0.038 |
96-104 |
2.2 Оценка констант связывания иммунных комплексов и специфичности иммунохимических взаимодействий
Для характеристики иммунных комплексов были определены константы образования иммунных комплексов Ка с помощью метода Скэтчарда.
Рис. 3. График Скэтчарда для нахождения констант связывания иммунного комплекса Ат -Аг Fusarium
Проводили серию опытов по определению концентрации свободного и связанного Аг при различных начальных концентрациях Аг и постоянной концентрации Ат в системе. Для определения несвязанного количества Аг использовали градуировочную зависимость действия Аг F. oxysporum на другую фермент-субстратную систему (тирозиназа - фенол), для которой установлено наличие активирующего эффекта.
Полученная зависимость взаимодействия Аг-Ат в координатах Скэтчарда имеет близкий к линейному характер, что свидетельствует об однородности используемых антител (рис. 3). Найденное значение константы связывания для Ат к F. oxysporum Ка = (6.2 ± 0.2) 109 (мг/мл)-1 указывает на достаточную прочность образующихся иммунных комплексов. Это позволяет проводить селективный анализ независимо от присутствия других грибковых патогенов.
Полученные результаты показывают, что предлагаемые иммуносенсоры могут быть использованы для определения содержания F. oxysporum в сельскохозяйственных продуктах.
2.3 Определение Аг F. oxysporum в сельскохозяйственной продукции
В связи с широкой распространенностью F. oxysporum и его способностью поражать разнообразные сельскохозяйственные культуры, представляло интерес количественно оценить его содержание в продуктах переработки зерна - пшеничной крупе.
Методика извлечения Аг F. oxysporum из крупы. Навеску образца (1 г) (пшеничной крупы) растирали в порошок, используя блендер фирмы Jiplai (Китай) и добавляли 10 мл водно-солевого буфера (фосфатного буфера рН 7.6). Смесь фильтровали на воронке трижды. Фильтраты объединили и центрифугировали в течение 15 мин при скорости 7000 об ./мин, после этого использовали для последующего определения F. oxysporum с помощью иммуносенсора на основе ЦДГ.
Методика определения содержания Аг F. oxysporum в образце крупы. В ячейку на 1800 мкл вносили 180 мкл раствора образца, полученного как описано выше, 180 мкл L-цистеина (с = 1 10-3 М), фосфатный буферный раствор (рН 7.6) и ЦДГ-иммуносенсор. Растворы инкубировали в течение 10 мин. Затем измеряли значение тока при потенциале +0.45 В.
В образцах пшеничной крупы («Каждый день», ОАО «МК Сарапул-молоко», г. Сарапул) F. oxysporum не обнаружен.
Возможность определения F. oxysporum с использованием разработанного ИФС оценена методом «введено - найдено».
цистеиндесульфгидраза иммуносенсор аналитический биосенсор
Заключение
Впервые показана возможность использования амперометрических ИФС с ЦДГ в качестве метки для определения Аг F. oxysporum, действие которого основано на сочетании иммунологической, ферментативной и электрохимической реакций.
Разработанный иммуносенсор позволил определять Аг F. oxysporum в концентрационном интервале 5 10-10-5 10-6 мг/мл, а нижняя граница определяемых содержаний составила 1 10-10 мг/мл.
Оценена константа связывания иммунных комплексов:
Ка = (6.2 ± 0.2) 109 (мг/мл)-1
Перекрестное реагирование полностью отсутствовало для Аг патогенных грибов Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger.
Разработана методика определения Аг F. oxysporum с помощью предлагаемого цистеиндесульгидразного ИФС в сельскохозяйственной продукции, апробирована на примере оценки качества пшеничной крупы. В исследуемых образцах F. oxysporum не был обнаружен.
Литература
1. Senes C.E.R., Saldan N.C., Costa W.F., Svidzinski T, Oliveira C.C. Identification of Fusarium oxysporum fungus in wheat based on chemical markers and qualitative GC-MS test // J. Braz. Chem. Soc. - 2018. - V. 29, No 12. - P. 2626-2635.
2. GragaM.G., Heijden I.M., Perdigao L., Taira C., Costa S.F., Levin A.S. Evaluation of two methods for direct detection of Fusarium spp. in water // J. Microbiol. Methods. - 2016. - V. 123. - P. 39-43.
3. Singh N., Kapoor R. Quick and accurate detection of Fusarium oxysporum f. sp. carthami in host tissue and soil using conventional and real-time PCR assay // World J. Microbiol. Biotechnol. - 2018. - V. 34, No 175. - P. 175-187.
4. Omori A.M. Ono E.Y.S., Bordini J.G, Hirozawa M.T., Fungaro M.H.P., OnoM.A. Detection of Fusarium verticillioides by PCR-ELISA based on FUM21 gene // Food Microbiol. - 2018. - V. 73. - P. 160-167.
5. Ge B., Wang B., Guo C., Sun S., Chen G., Wang X., Zhu Z., Duan C. Composition and quantitative analysis of Fusarium species in maize rhizosphere soil // Sci. Agric. Sin. - 2018. - V. 51, No 19. - P. 3683-3693.
6. Mishra R.K., Pandey B.K., Muthukumar M., Pathak N., Zeeshan M. Detection of Fusarium wilt pathogens of Psidium guajava L. in soil using culture independent PCR (ciPCR) // Saudi J. Biol. Sci. - 2013. - V. 20, No 1. - P. 51-56.
7. Crespo-Sempere A., Estiarte N., Marm S., Sanchis V., Ramos A.J. Propidium monoazide combined with real-time quantitative PCR to quantify viable Alternaria spp. contamination in tomato products // Int. J. Food Microbiol. - 2013. - V 165, No 3. - P. 214-220.
8. Kumar S., Singh R., Kashyap P.L., Srivastava A.K. Rapid detection and quantification of Alternaria solani in tomato // Sci. Hortic. - 2013. - V 151. - P. 184-189.
9. von Hertwig A.M., Sant'Ana A.S., Sartori D., Silva J., Nascimento M.S., Iamanaka B.T., Pelegrinelli Fungaro M.H., Taniwaki M.H. Real-time PCR-based method for rapid detection of Aspergillus niger and Aspergillus welwitschiae isolated from coffee // J. Microbiol. Methods. - 2018. - V 148. - P. 87-92.
10. Nikitin M., Deych K., Grevtseva I., Girsova N.V, Kuznetsova M., Pridannikov M., Dzhavakhiya V., Statsyuk N., Golikov A.G Preserved microarrays for simultaneous detection and identification of six fungal potato pathogens with the use of real-time PCR in matrix format // Biosensors. - 2018. - V 8, No 4. - P. 129-137.
11. De la Lastra E., Basallote-Ureba M.J., De los Santos B., Miranda L., Vela-Delgado M.D., Capote N. A TaqMan real-time polymerase chain reaction assay for accurate detection and quantification of Fusarium solani in strawberry plants and soil // Sci. Hortic. - 2018. - V. 237. - P. 128-134.
12. Shan L., Haseeb H.A., Zhang J., Zhang D. Jeffers D.P., Dai X., Guo W. A loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for the rapid detection of toxigenic Fusarium temperatum in maize stalks and kernels // Int. J. Food Microbiol. - 2019. - N. 291. - P. 72-78.
13. Lan C., Ruan H., Yang X., Yao J. Jiang J. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and specific detection of Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum Owen // Phytoparasitica. - 2018. - V 46. - P. 283-293.
14. Pu J., Xie Y., Zhang H., ZhangX., Qi Y., Peng J. Development of a real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification assay for rapid and quantitative detection of Fusarium mangiferae associated with mango malformation // Physiol. Mol. Plant Pathol. - V 86. - P. 81-88.
15. Denschlag C., Rieder J., Vogel R.F., Niessen L. Real-time loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for group specific detection of important trichothecene producing Fusarium species in wheat // Int. J. Food Microbiol. - 2014. - V 177. - P. 117-127.
16. Jaillais B., Roumet P., Pinson-Gadais L., Bertrand D. Detection of Fusarium head blight contamination in wheat kernels by multivariate imaging // Food Control. - 2015. - V. 54. - P. 250-258.
17. Kaya-Celiker H., Mallikarjunan P.K., Kaaya A. Mid-infrared spectroscopy for discrimination and classification of Aspergillus spp. contamination in peanuts // Food Control. - V 52. - P. 103-111.
18. Liang P.-S., Slaughter D.C., Ortega-Beltran A., Michailides T.J. Detection of fungal infection in almond kernels using near-infrared reflectance spectroscopy // Biosyst. Eng. - 2015. - V 137. - P. 64-72.
19. Pan T., Sun D.-W., Pu H., Wei Q., Xiao W., Wang Q.-J. Detection of A. alternata from pear juice using surface-enhanced Raman spectroscopy based silver nanodots array // J. Food Eng. - 2017. - V 215. - P. 147-155.
20. Shen F., Zhao T., Jiang X., Liu X., Fang Y., Liu Q., Hu Q., Liu X. On-line detection of toxigenic fungal infection in wheat by visible/near infrared spectroscopy // J. Food Sci. Technol. - 2019. - V. 109. - P. 216-224.
21. Shen F., Wu Q., Liu P., Jiang X., Fang Y., Cao C. Detection of Aspergillus spp. contamination levels in peanuts by near infrared spectroscopy and electronic nose // Food Control. - 2018. - V 93. - P. 1-8.
22. Tamburini E., Mamolini E., De Bastiani M., Marchetti M.G. Quantitative determination of Fusarium proliferatum concentration in intact garlic cloves using near-infrared spectroscopy // Sensors. - 2016. - V. 16, No 7. - P. 1099-1112.
23. Wu Q., Xie L., Xu H. Determination of toxigenic fungi and aflatoxins in nuts and dried fruits using imaging and spectroscopic techniques // Food Chem. - 2018. - V 252. - P. 228-242.
24. Saldan N.C. Almeida R.T.R., Avmcola A., Porto C., Galuch M.B., Magon T.F.S., Pilau E.J., Svidzinski T.I.E., Oliveira C.C. Development of an analytical method for identification of Aspergillus flavus based on chemical markers using HPLC-MS // Food Chem. - 2018. - V. 241. - P. 113-121.
25. Gu S., Wang J., Wang Y. Early discrimination and growth tracking of Aspergillus spp. contamination in rice kernels using electronic nose // Food Chem. - 2019. - V 292. - P. 325-335.
26. Erler A. Riebe D., Beitz T., Lohmannsroben H.-G., Grothusheitkamp D., Kunz T., Methner F.-J. Detection of volatile organic compounds in the headspace above mold fungi by GC-soft X-radiation-based APCI-MS // J. Mass Spectrom. - 2018. - V. 53, No 10. - P. 911-920.
27. Siddiquee S., Rovina K., Yusof N.A., Rodrigues K.F., Suryani S. Nanoparticle-enhanced electrochemical biosensor with DNA immobilization and hybridization of Trichoderma harzianum gene // Sens. Bio-Sens. Res. - 2014. - V 2. - P. 16-22.
28. Peltomaa R., Vaghini S., Patino B., Benito-Pena E., Moreno-Bondi M. Species-specific optical genosensors for the detection of mycotoxigenic Fusarium fungi in food samples // Anal. Chim. Acta. - 2016. - V. 935. - P. 231-238.
29. Cecchini F., Manzano M., Mandabi Y., Perelman E., Marks R.S. Chemiluminescent DNA optical fibre sensor for Brettanomyces bruxellensis detection // J. Biotechnol. - 2012. - V. 157, No 1. - P. 25-30.
30. Wee E.J.H., Lau H.Y., Botella J.R., Trau M. Re-purposing bridging flocculation for onsite, rapid, qualitative DNA detection in resource-poor settings // Chem. Commun. - 2015. - V. 51, No 27. - P. 5828-5831.
31. Zhan F., Wang T., Iradukunda L., Zhan J. A gold nanoparticle-based lateral flow biosensor for sensitive visual detection of the potato late blight pathogen, Phytophthora infestans // Anal. Chim. Acta. - 2018. - V 1036. - P. 153-161.
32. Miranda B.S., Linares E.M., Thalhammer S., Kubota L.T. Development of a disposable and highly sensitive paper-based immunosensor for early diagnosis of Asian soybean rust // Biosens. Bioelectron. - 2013. - V. 45. - P. 123-128.
33. Medyantseva E.P., Khaldeeva E.V., Glushko N.I., Budnikov H.C. Amperometric enzyme immunosensor for the determination of the antigen of the pathogenic fungi Trichophyton rubrum //Anal. Chim. Acta. - 2000. - V 411, No 1-2. - P. 13-18.
34. KavandА., Anton N., Vandamme T., Serra C.A., Chan-Seng D. Synthesis and functionalization of hyperbranched polymers for targeted drug delivery / /J. Controlled Release. - 2020. - V. 321. - P. 285-311.
35. Медянцева Э.П., Кремлева Н.В., Будников ГК., Бормотова Ю.И. Амперометрический биосенсор для определения свинца и кадмия // Журн. аналит. химии. - 1999. - Т. 54, №2. - С. 166-170.
36. Ёсида К. Электроокисление в органической химии. Роль катион радикалов как интермедиатов в синтезе. - М.: Мир, 1987. - 336 с.
37. Егоров А.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. - М.: Высш. шк., 1991. - 288 с.
38. Мусил Я., Новакова О., Кунц. К. Современная биохимия в схемах. - М.: Мир, 1994. - 44 с.
Figure Captions
Fig. 1. Schematic representation of the action of enzyme immunoassay sensors based on immobilized Ab against Fusarium oxysporum Ag and the enzyme (E) includes: co-immobilized enzyme and Ab (a), Ag in solution (b), immune complex that is formed and variants of the substrate access to the active enzyme surface (c).
Fig. 2. Voltammograms of the electrooxidation of a 1-10-3 M cysteine solution in phosphate buffer (pH 7.6) (1), in the presence of L-cysteine desulfhydrase (2), in the absence of L-cysteine desulfhydrase (4), in the presence of Fusarium oxysporum Ag and L-cysteine desulfhydrase (3) at the planar graphite electrode.
Fig. 3. Scatchard plot for determining the binding constant of the Ab-Ag immune complex of Fusarium oxysporum.
References
1. Senes C.E.R., Saldan N.C., Costa W.F., Svidzinski T., Oliveira C.C. Identification of Fusarium oxysporum fungus in wheat based on chemical markers and qualitative GC-MS test. J. Braz. Chem. Soc, 2018, vol. 29, no. 12, pp. 2626-2635.
2. Graja M.G., Heijden I.M., Perdigao L., Taira C., Costa S.F., Levin A.S. Evaluation of two methods for direct detection of Fusarium spp. in water. J. Microbiol. Methods, 2016, vol. 123, pp. 39-43.
3. Singh N., Kapoor R. Quick and accurate detection of Fusarium oxysporum f. sp. carthami in host tissue and soil using conventional and real-time PCR assay. World J. Microbiol. Biotechnol., 2018, vol. 34, no. 175, pp. 175-187.
4. Omori A.M. Ono E.Y.S., Bordini J.G., Hirozawa M.T., Fungaro M.H.P., Ono M.A. Detection of Fusarium verticillioides by PCR-ELISA based on FUM21 gene. Food Microbiol., 2018, vol. 73, pp. 160-167.
5. Ge B., Wang B., Guo C., Sun S., Chen G., Wang X., Zhu Z., Duan C. Composition and quantitative analysis of Fusarium species in maize rhizosphere soil. Sci. Agric. Sin., 2018, vol. 51, no. 19, pp. 3683-3693.
6. Mishra R.K., Pandey B.K., Muthukumar M., Pathak N., Zeeshan M. Detection of Fusarium wilt pathogens of Psidium guajava L. in soil using culture independent PCR (ciPCR). Saudi J. Biol. Sci, 2013, vol. 20, no. 1, pp. 51-56.
7. Crespo-Sempere A., Estiarte N., Marin S., Sanchis V., Ramos A.J. Propidium monoazide combined with real-time quantitative PCR to quantify viable Alternaria spp. contamination in tomato products. Int. J. Food Microbiol., 2013, vol. 165, no. 3, pp. 214-220.
8. Kumar S., Singh R., Kashyap P.L., Srivastava A.K. Rapid detection and quantification of Alternaria solani in tomato. Sci. Hortic., 2013, vol. 151, pp. 184-189.
9. von Hertwig A.M., Sant'Ana A.S., Sartori D., Silva J., Nascimento M.S., Iamanaka B.T., Pelegrinelli Fungaro M.H., Taniwaki M.H. Real-time PCR-based method for rapid detection of Aspergillus niger and Aspergillus welwitschiae isolated from coffee. J. Microbiol. Methods, 2018, vol. 148, pp. 87-92.
10. Nikitin M., Deych K., Grevtseva I., Girsova N.V., Kuznetsova M., Pridannikov M., Dzhavakhiya V., Statsyuk N., Golikov A.G. Preserved microarrays for simultaneous detection and identification of six fungal potato pathogens with the use of real-time PCR in matrix format. Biosensors, 2018, vol. 8, no. 4, pp. 129-137.