Материал: Аутентичного материала

Высокосульфатированная подфракция CcFl-f-1,5 составляла около 70% от исходного фукоидана (CcFl-f) (табл. 5.3). Около 90% от суммы моносахаридов этой подфракций были представлены Fuc и Gal в соотношении 1,0:0,28. Основную часть подфракций CcFl-f-1,5 составили фукоиданы со средней молекулярной массой 160 кДа, в меньшем количестве — 70 кДа.

118



ю.о

15.0

20.0

мин

Рис. 5.3. Молекулярно-массовое распределение подфракций CcFl-f-0,5 (а) и CcFl-f-1,5 (б) фукоидана из водоросли C.costata. (Колонки (7,5 мм х 300 мм) Shodex Asahipak GS-520 HQ и GS-620 HQ)

Следовательно, фракция CcFl содержала, как минимум, фукоиданы двух структурных типов — слабозаряженный уро-нофукоманнан и высо-косульфатированный галактофукан в весовом соотношении 1:2.

Наличие различных структурных типов в составе общих фракций фукоиданов было отмечено для других видов водорослей. При фракционировании сульфа-тированного полисахарида, выделенного из F. vesiculosus(Sigma), авторы получили фукоиданы различного строения. Как основной компонент был выделен типичный фукан, содержащий только сульфатированную фукозу, как минорный компонент — низкосульфатированный гетерополисахарид, содержащий кроме фукозы другие моносахариды и высокий процент уроновых кислот (Nishino et al., 1994, Fitton, 2005).

При экстрагировании водоросли Adenocytisutricularisраствором соляной кислоты при 20°С получили галактофукан, который показал высокое ингибирующее действие против вирусов герпеса HSV-1 и HSV-2. Продукты экстракции при температуре 70°С содержали уронофукан, который противовирусной активности не проявлял. Фракция уронофу-кана, кроме фукозы, характеризовалась высоким содержанием уроновых кислот и маннозы, другие моносахариды находились в ней в минорных количествах. Фракция отличалась сравнительно низкими молекулярными массами (Ponce et al, 2003). Hemmingson с соавторами (Hemmingson et al., 2006) выделили из Undariapinnatifida(цельное растение, в котором спорофиллы составляли 30% от общего веса) при комнатной температуре с выходом 4,5% суммарный полисахарид, который показал высокое ингибирующее действие против вирусов герпеса HSV-1 и HSV-2. При фракционировании полисахарида ионообменной хроматографией были получены 2 фракции F1M и F2M в соотношении 1,0:3,5, которые показали разное противовирусное действие. Более сульфатированная фракция галактофукана (F2M)

показала высокое ингибирующее действие

119

против вируса герпеса HSV-1, практически аналогичное исходному образцу. Авторами также было установлено, что полисахарид продолжал показывать высокую активность против вируса герпеса HSV-1 при соотношении фракций F1M и F2M как 1:3, так и 1:1. При изменении соотношения фракций, равное 3:1, ингибирующее действие смеси полисахаридов против вируса герпеса HSV-1 уменьшилось вдвое.

Оптимизация условий выделения фукоиданов из дальневосточной бурой водоросли Fucusevanescens

Извлечение веществ из растительного сырья является сложным физико-химическим процессом, на протекание которого влияют несколько факторов. При разработке технологии необходимо определять оптимальные условия для экстракции с максимальным выходом однородного по составу продукта.

Оптимизацию условий экстракции фукоидана проводили на примере бурой водоросли F. evanescens. В дальневосточных морях эта водоросль является наиболее перспективным сырьем для получения фукоидана, представляющего собой сульфатированный фукан. В качестве сырья использовали сухую, предварительно обработанную органическими растворителями, водоросль, которая содержала до 14% фукоидана (далее по тексту — сырье).

В предварительных экспериментах были выбраны следующие условия экстракции фукоидана из сырья: средний размер частиц сырья — 5 мм, кислотность экстракционной среды рН 2,5, отношение водоросль: экстрагент — 1:15, температура — 50°С, кратность экстракций — 2 (Имбс и др., 2012). Для проверки степени влияния каждого из этих факторов на процесс экстракции фукоидана был проведен оптимизационный эксперимент по типу дробной реплики с двумя уровнями пяти переменных (2^{5 2}) с определяющими контрастами (Пономарев, 1976). Задача оптимизации сводилась к определению значений условий экстракции, обеспечивающих максимальный выход фукоидана и минимальное содержание сопутствующих веществ. План и результаты факторного эксперимента приведены в таблице 5.4.

Таблица 5.4 План и результаты факторного эксперимента (с двумя уровнями пяти переменных) по оптимизации экстракции фукоидана из F.

evanescens

опыта	Факторы эксперимента						Yi, %		Y2, %		Y3, %		Y4, %
	Хо	Xi,PH	л2, раз	Хз.ч	Х4,°С	л5, мм
1	1:15	1,5	3	2	65	2		78,0		27,4		45,1		88,4

120

2	1:15	3,5	3	2	35	8	55,6	21,9	76,9	46,0
3	1:15	1,5	1	2	35	8	46,0	14,9	69,2	62,0
4	1:15	3,5	1	2	65	2	44,2	15,0	76,4	54,0
5	1:15	1,5	3	4	35	2	52,6	21,2	46,8	74,2
6	1:15	3,5	3	4	65	8	94,8	26,4	93,4	54,0
7	1:15	1,5	1	4	65	8	70,0	19,5	65,9	76,0
8	1:15	3,5	1	4	35	2	35,2	13,1	84,8	44,2
9	1:15	2,5	2	3	50	5	49,0	19,4	64,1	56,4
10	1:15	2,5	2	3	50	5	62,0	18,4	70,3	67,4
11	1:15	2,5	2	3	50	5	48,0	20,6	54,7	60,0
12	1:15	2,5	2	3	50	5	50,0	19,4	65,0	57,0

Выход процесса Y (функция отклика) определяли, как Y — выход фукоидана (% от содержания в сырье); Y₂ — выход экстрактивных веществ (% от веса сырья); Y₃ — выход водорастворимых полисахаридов (% от веса экстрактивных веществ); Y₄ — выход фукоидана (% от веса водорастворимых полисахаридов). Независимыми переменными (X) были: Х₀ — соотношение сырье: экстрагент; X — значение рН; Х₂ — кратность экстракции, раз; Х₃ — продолжительность экстрагирования, ч; Х₄ — температура, °С; Х₅ — степень измельчения сырья, мм.

Для определения ошибки эксперимента было поставлено 4 опыта в нулевых условиях (опыты 9-12, табл. 5.4).

По результатам факторного эксперимента описание функции отклика в виде линейных уравнений регрессии имели вид: Y₁₌ 59,6 - 2,1 Х₁ + 10,7 Х₂ + 5,8 Х₃ + 9,9 Х₄ + 7,1Х₅ (1)

Y₂= 19,9 - 0,8^ + 4,3 Х₂ + 0,6 Х₃ + 1,7 Х₄ + 0,8 Х₅ (2)

Y₃= 69,8 + 13,1 Xj + 4,3 Х₂ + 0,8 Х₃ + 2,5 Х₄ + 6,5 Х₅ (3)

Y₄= 62,4 - 12,8 Xj + 3,3 Х₂ + 2,2 Х₃ + 3,3 Х₄ - 2,8Х₅ (4)

Проверка значимости коэффициентов при факторах X в уравнениях (1-4) по критерию Стьюдента (с надежностью 95%) показала, что в уравнении (1) и (2) значимо отличны от нуля только коэффициенты при Х₂, Х₄ и Х₅, а в уравнениях (3) и (4) - при Х_г

Это означает, что в выбранном диапазоне величин фукторов увеличение кратности (Х₂) и температуры экстракции (Х₄) должно приводить к увеличению выхода фукоидана (Y ) и экстрактивных веществ (Y ). При увеличении рН среды (Х_:) следует ожидать повышения доли полисахаридов в экстрактивных веществах (Y ) и уменьшения доли фукоидана во фракции полисахаридов (Y₄). Поскольку уменьшение размера частиц сы-

121

рья (X ) при статическом режиме экстракции не приводило к повышению выхода фукоидана, рекомендовано сырье измельчать до размера 1—3 см.

Как показали результаты регрессионного анализа уравнения (1), оно удовлетворительно описывает выход фукоидана в процессе экстракции. Экспериментальная проверка модели в условиях иных, чем те, которые использовались для получения уравнения (1), подтвердила адекватность ее применения для описания процесса (F_3Kcn = 5,42; Б_та6л = 5,79; р = 0,05).

Для масштабирования процесса экстракции фукоидана из Е evanescensнеобходимо учитывать следующие закономерности. На выход фукоидана положительно влияло повышение температуры экстракции. Однако, учитывая, что экстрагирование проводят при достаточно низких значениях рН, повышение температуры выше 70°С может привести к частичному кислотному гидролизу фукоидана. Увеличение кратности экстрагирования также положительно влияло на выход фукоидана. Изменение рН в заданном интервале (1,5—3,5) влияло на выход фракции водорастворимых полисахаридов и содержание фукоидана в этой фракции. Варьируя значение рН от 1,5 до 3,5 и выше можно получать фракцию полисахаридов с разным содержанием фукоидана и альгина-та. Для получения фракции полисахаридов, обогащенной фукоиданом, экстракцию следует проводить при рН 2,0—2,5.

Была проведена 3-х кратная экстракция сырья при 65°С, результаты опыта приведены в таблице 5.5. Составы 1 и 2 экстрактов практически идентичны и их следует объединить. При необходимости получения гетерогенного фукоидана можно проводить 3-ю экстракцию, выход которой составляет 12% от суммарного выхода.

По результатам оптимизации были выбраны условия экстракции фукоидана: рН 2,5; при 65±5°С; кратность экстракции два раза по 3 ч, гидромодуль 1:15; при этом содержание фукоидана в сумме экстрактивных веществ составило от 40 до 50%.

Для очистки фукоидана F. evanescens от ламинарана и низкомолекулярных примесей использовали ультрафильтрацию на мембранах с пределом удерживания 5 кДа. Одновременно с очисткой экстракта происходило его концентрирование. Конечный продукт получали осаждением фукоидана из концентрата этиловым спиртом. Характеристика экстрактов приведена в таблице 5.6. В результате очистки был получен препарат, содержащий 86,7% фукоидана (табл. 5.6).

122

Таблица 5.5 Характеристика экстрактов, выделенных