Автореферат: Биохимические механизмы дезинтеграции эритроцитов человека в различных условиях функционирования

2. Механизмы повреждения эритроцитов в условиях действия лекарственных и химических препаратов

Традиционным лечением ИБС является лечение с применением нитропрепаратов, оказывающих значительный вазоделатирующий эффект за счет образования окиси азота. Однако, нитританионы, поступая в кровь, оказывают повреждающее воздействие на эритроцитарные клетки. Нами было изучено действие нитрита натрия и L-аргинина (L-арг), который является субстратом для производства эндогенного NO (Ванин А.Ф. и др., 1991). Добавление нитрита натрия и L-арг в эквимолярной концентрации (2 мМ/л) сопровождалось ингибированием фосфолипизы А₂, процент ингибирования был выше у нитрита натрия. Подобный эффект наблюдается и в случае использования эритроцитов , полученных из крови больных инфарктом миокарда. Однако, ингибирование фосфолипазы А₂ является непродолжительным и через 15 минут инкубации наблюдается рост активности фермента, то есть регулирующее действие нитртанионов непродолжительно. Так как нитриты являются традиционным лекарственным средством для лечения ИБС, нами было изучено действие нитританионов и L-аргинина на эритроциты и цельную кровь в условиях лактоацидоза (7,5 мМ и 10 мМ).

Действие нитританионов на фоне лактоацидоза характеризуются более высокой скоростью дезинтеграции, о чем свидетельствует больший процент метгемоглобина, активация НАДН-цитохром-b₅-редуктазы. Хотя следует отметить, что в начальный период нитриты замедляют процессы дезинтеграции, вероятно, за счет угнетения активности фосфолипаз в условиях активации гуанилатциклазной системы (Северина И.С., 1995). Мы наблюдали снижение активности 5`-нуклеотидазы, улучшение деформируемости клеток. Однако продолжается снижение активности АТФ-зы, уменьшается скорость поступления глюкозы в клетку. Все это в конечном итоге будет способствовать ускорению повреждения эритроцитов в условиях лактоацидоза.

Повреждающее действие NO во многом связано с генерацией ONOO, который сам и продукты его распада разрушают биологические структуры путем нитрозолирования (Padmaja S., Huie R., 1993).

Протекторным действием обладают доноры SH-групп, способные взаимодействовать с ONOO с образованием нитрозотиолов. Найден защитный эффект цистенина, унитиола ( Гамалей И.А., Ключин И.В., 2000).

Таблица 5.

Действие нитрозотиолов на фоне лактоацидоза на эритроциты

Примечание *P<0,01 по отношению к пробам с лактатом

Нами было изучено действие нитрозотиолов на эритроциты человека в условиях лактоацидоза и без него. Действие цистеина и унитиола в сочетании с эквимолярной концентрацией нитританиона снижает уровень повреждений и скорость метгемоглобинобразования по сравнению с воздействием только нитританионов. Протекторное действие доноров SH-групп обнаруживается и в условиях лактоацидоза. Совместное влияние нитританионов, доноров SH-групп на фоне лактоацидоза характеризуется потерей защитного воздействия цистеина и скорость процессов дезинтеграции остается высокой и по некоторым показателям даже выше, чем в условиях действия нитританионов в сочетании с лактоацидозом ( табл. 5). Доноры SH-групп теряют протекторные свойства и, возможно, приобретают прооксидантные. Кроме того, известно ингибирующее влияние нитрозотиолов на глицероальдегидфосфатдегидрогеназу и ЛДГ (Языкова М.Ю., 2000).

3. Механизмы дезинтеграции эритроцитов в условиях гипо- и гипергликемии

Глюкоза является основным энергетическим метаболитом в эритроцитах. Она утилизируется в 2-х процессах: гликолизе и пентозофосфатном пути окисления (Атауллаханов Ф.И., 1981). Избыток глюкозы приводит к активации неферментативного взаимодействия с -аминогруппами лизина в белковых молекулах (гликирование)(Голубев А.Г., 1996). В эритроцитах прежде всего гликированию подвергается гемоглобин. В норме содержание гликированного гемоглобина колеблется в пределах 4-6%, у больных сахарным диабетом в зависимости от уровня глюкозы в крови содержание гликированного гемоглобина увеличивается до 7-12% (Торосян Л.Г., 1988). Гликированию подвергаются и другие белки и фосфолипидный слой, что ведет к нарушению кислородтранспортной функции эритроцитов. Наши исследования показали, что гипергликемия дозозависимо ускоряет процессы дезинтеграции эритроцитов. Основным механизмом здесь является повреждение функциональных белков за счет процессов гликирования. В условиях действия 25 мМ/л глюкозы мы наблюдали почти 4-х кратное увеличение степени гликозилированности мембранных белков клетки (рис.1), снижение активности каталазы за счет, вероятно, гликирования по лизину, расположенному вблизи геминовой группировки, определяющей ферментативную активность каталазы. Гликирование белков ведет к повышению вероятности неспецифической агрегации белков, снижая возможность образования эффективных белок-белковых комплексов и увеличивает мембранную проницаемость клеток (рис.1) и скорость процессов денатурации белков.

Сахарный диабет часто является заболеванием, сопутствующим ИБС и, наоборот, ишемическая болезнь развивается на фоне сахарного диабета. У больных ИБС, осложненной сахарным диабетом, состояние гипергликемии может сопровождаться гипоксией и лактоацидозом, поэтому нами было изучено сочетание действия условий гипергликемии и лактоацидоза (7,5 мМ/л).

Гипергликемия в сочетании с лактоацидозом приводит к ускорению аутоокисления гемоглобина как в эритроцитах доноров, так и в эритроцитах больных ИБС, осложненной сахарным диабетом. Наблюдается увеличение фракции мембраносвязанного гемоглобина, снижение активных концентраций каталазы, причем степень угнетения ферментативной активности оказалась больше в эритроцитах, выделенных из крови больных.

Рис.1. Степень гликозилированности мембран, у.е. (1) и мембранная проницаемость для мочевины, % (2) в условиях гипергликемии (эритроциты доноров).

Условия даже небольшой гипогликемии (2,5 мМ) в сочетании с лактоацидозом оказывает большее повреждающее воздействие, чем небольшой избыток глюкозы. Основной причиной этого является усугубление и ускорение развития энергодефицита при недостатке глюкозы. Однако скорость метгемоглобинобразования выше в условиях гипергликемии в сочетании с лактоацидозом. Это обстоятельство объясняется непосредственным влиянием гликирования гемоглобина на скорость его окисления. Процент содержания метгемоглобина увеличивается при сочетании лактоацидоза с гипогликемией в 1,35 раза, при сочетании с гипергликемией (10 мМ) в 2,2 раза.

В эритроцитах больных ИБС, осложненной сахарным диабетом, наблюдается иное направление изменений содержания метгемоглобина при сочетании гипо- и гипергликемии с лактоацидозом. Процент роста метгемоглобина в условиях гипогликемия+лактоацидоз выше, чем в условиях гипергликемия+лактоацидоз.Таким образом, для больных ИБС, осложненной сахарным диабетом увеличение содержания молочной кислоты в плазме крови окажет наиболее повреждающее воздействие в условиях гипогликемии, чем гипергликемии.

В качестве модели для изучения механизмов дезинтеграции эритроцитов в условиях энергодефицита и лактоацидоза нами было использовано хранение крови в холодильной камере при 10⁰-12⁰С. Эти условия позволяют (за счет замедления процессов метаболизма) получить популяцию клеток с постепенным развитием дезинтеграционных процессов. Определение содержания глюкозы и молочной кислоты в плазме храненной крови показало на третьи сутки хранения, что количество глюкозы уменьшиловь в 3,75 раз, а молочной кислоты - увеличилось в 2,25 раза.

Популяция эритроцитов, полученных из храненной в течение 3-х дней крови, характеризуется изменениями, аналогичными для сочетания гипогликемии и лактоацидоза: наблюдалось снижение сродства гемоглобина к кислороду, увеличение процента метгемоглобина и мембраносвязанного гемоглобина, рост скорости химического окисления гемоглобина, уменьшение антиокислительной активности (АОА) эритроцитарных гемолизатов, увеличение мебранной проницаемости для мочевины, снижение активных концентраций каталазы. Все изменения являются непосредственным результатом снижения количества АТФ за счет уменьшения темпов синтеза.

Об этом свидетельствует уменьшение уровня поглощения хлорными экстрактами эритроцитов в области 254-258 нм (область максимального поглощения адениловых нуклеозидфосфатов)(рис.2). Уменьшение количества АТФ при хранении крови подтверждается данными Слобожаниной Е.И. и др.(1982).

Рис.2. Спектры поглощения среднемолекулярных соединений хлорных экстрактов свежей (1) и храненной крови (3-е суток), у.е.

Таким образом, эритроциты из храненной крови могут служить моделью популяции клеток, поврежденных условиями энергодефицита и лактоацидоза. Эта модель была использована нами для изучения влияния доноров SH-групп на скорость процессов дезинтеграции эритроцитов и спектров коротких пептидов в ТХУ-экстрактах клеток. Добавление в храненную кровь унитиола (0,24 мМ) сопровождается при последующей инкубации при 37⁰С уменьшением скорости метгемоглобинобразования, снижением фракции мембраносвязанного гемоглобина. Это связано с использованием SH-групп для стабилизации работы метгемоглобинредуктазных систем, снижением скорости ПОЛ в мембране. Унитиол в разовой терапевтической дозе повышает АОА эритроцитарных гемолизатов, снижает мембранную проницаемость для мочевины и приводит к уменьшению скорости дезинтеграции мембран.

Изучение спектров коротких пептидов из ТХУ-экстрактов свежей и храненной крови показало, что они имеют существенные отличия (табл.6). Например, 11-членный пептид, являющийся фрагментом -цепи гемоглобина и обладающий гемопоэтической активностью, обнаруживается и в свежей и храненной крови, но площадь пика данного пептида возрастает по мере увеличения сроков хранения, а, следовательно, и нарастания процента поврежденных клеток в популяции.

Обнаружение пептидов, обладающих гемопоэтической активностью в экстрактах из свежей крови обусловлено изначальной гетерогенностью популяции клеток, в которой всегда присутствует определенный процент эритроцитов с высокой скоростью процессов дезинтеграции (старые клетки).

Таблица 6.

Факторы удерживания (k), аминокислотная последовательность и биологические свойства идентифицированных пептидов, выделенных из экстрактов свежей и храненной крови

Мы предположили, что причиной активации мембранных протеаз могут стать определенное состояние белок-белковых и белок-липидных взаимодействий в мембране, что в свою очередь определяется степенью дезинтегрированности клеток. Избыток протонов, развивающийся энергодефицит, ускорение аутоокисления гемоглобина, его углубление в мембрану и, наконец, формирование кластеров гемихрома, могут способствовать активации высокоспецифических протеаз и существенно изменять спектр производимых клеткой пептидных соединений.

4. Дестабилизация эритроцитов при действии бета-блокаторов и антагонистов кальция в условиях гипоксии, лактоацидоза, энергодефицита и гиперадреналинемии

Действие антагонистов кальция (финаптин, нифегексал) и бета-блокаторов (талинолол, обзидан) в условиях лактоацидоза характеризуется уменьшением скорости метгемоглобинобразования, снижением доли мембраносвязанного гемоглобина, наблюдается улучшение мембранной проницаемости и механической резистентности мембран клеток, увеличение активных концентраций каталазы. Таким образом, антагонисты кальция и бета-блокаторы в разовых терапевтических дозах оказывают благоприятное действие на эритроцитарные клетки в условиях лактоацидоза (7,5 мМ). Механизм данного явления, возможно, состоит в оптимизации кальций-зависимых процессов, что стабилизирует работу основных систем клетки.