На правах рукописи
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Биологическая характеристика штамма ВН-96 вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней и разработка биотехнологических параметров его культивирования
03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Симоненко Наталья Валерьевна
Саратов 2011
Работа выполнена в Государственном научном учреждении Саратовском научно-исследовательском ветеринарном институте Россельхозакадмии
Научный руководитель доктор ветеринарных наук
Ласкавый Владислав Николаевич
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, доцент
Гулий Ольга Ивановна,
доктор биологических наук, профессор
Хайруллин Рамиль Магзинурович
Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»
Защита диссертации состоится «16» июня 2011 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова».
Автореферат диссертации разослан «11» мая 2011 г. и размещен на сайте: www.sgau.ru
Отзывы на автореферат направлять по адресу:410012, г. Саратов, Театральная пл.1, ученому секретарю диссертационного совета.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор биологических наук, профессор Л.В. Карпунина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Трансмиссивный (вирусный) гастроэнтерит свиней (ТГЭС) - остро протекающая, высоко контагиозная болезнь, которая поражает животных всех возрастных групп, но главным образом поросят до 3-х месячного возраста и наносит значительный экономический ущерб промышленному свиноводству (Ястребов, 1999; Сергеев, 2007; Lanteir et al., 1990; Saif, 1999).
Определённые успехи в борьбе с ТГЭС связаны с внедрением в практику живых культуральных моно- и ассоциированных вакцин, результативность применения которых в крупных свинокомплексах, как правило, недостаточно эффективна, что связано с существенными нарушениями технологии содержания и кормления, несоблюдением обязательных ветеринарно-санитарных требований, перегруппировкой и завозом из отдалённых регионов России и зарубежных стран животных, хронически инфицированных вирусами и бактериями с различным уровнем патогенности (Ласкавый, 1998; Алипер, 2002; Красочко и др., 2005; Ласкавый и др., 2007).
За последние 10-15 лет в мире резко возрос объем научных разработок, связанных с более широким применением перевиваемых линий клеток (ПЛК) в качестве субстрата для производства иммунобиологических препаратов (ИБП). Важное место в решении задач применения ПЛК в биотехнологии занимают вопросы выбора, контроля и стандартизации свойств, совершенствования технологии культивирования ПЛК, создания рабочих и посевных банков клеток в жидком азоте, поиска и апробации новых более эффективных антибактериальных препаратов, а также проблем контаминации и деконтаминации культур клеток и ИБП от бактерий и микоплазм (Тарасов, 1990; Ночевный, 2002; Герасимов, 2006).
Исследования, направленные на поиск, паспортизацию и стандартизацию ПЛК, предназначенных для получения вируса ТГЭС с выраженными антигенными и иммуногенными свойствами, а также разработка более стабильного по генетическим и иммунобиологическим показателям авирулентного штамма вируса ТГЭС, пригодного для профилактики данного заболевания у свиней разных половозрастных групп, является актуальной задачей на современном этапе и имеет большое практическое значение.
Цель работы - изучение биологических свойств штамма ВН-96 вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, оптимизация условий его культивирования в перевиваемой линии клеток и обоснование использования в качестве потенциального вакцинного препарата.
Для достижения поставленной цели нами были определены следующие задачи:
1. Провести селекцию штамма ВН-96 вируса ТГЭС и изучить его физико-химические свойства.
2. Оценить в сравнительном аспекте чувствительности первичной и перевиваемых тест-культур клеток к вирусу ТГЭС; провести отбор наиболее перспективной ПЛК в качестве субстрата для серийного производства вирусного антигена.
3. Подобрать средства и методы деконтаминации тест-культур с использованием моно- и комплексных препаратов на основе фторхинолонов и поверхностно активных веществ;
4. Осуществить стандартизацию и паспортизацию культуральной модели в качестве субстрата для получения штамма ВН-96 вируса ТГЭС;
5. Определить оптимальные условия культивирования штамма ВН-96 вируса ТГЭС стационарным и роллерным методами; оптимизация условий стабилизации штамма ВН-96 вируса ТГЭС;
6. Изучить антигенные и иммуногенные свойства штамма ВН-96 вируса ТГЭС; обосновать перспективность его использования в качестве вакцинного препарата.
Научная новизна. Впервые выделен и изучен штамм ВН-96 вируса ТГЭС, определены оптимальные условия его культивирования и изучена бляшкообразующая способность. На основании изучения антигенных и иммуногенных свойств обоснована перспективность использования штамма ВН-96 вируса ТГЭС в качестве вакцинного препарата.
Впервые доказана возможность и перспективность использования метода проточной цитометрии для экспресс-оценки культуральных, цитометрических и морфологических показателей, а также выбора наиболее перспективной культуральной модели для репродукции вируса ТГЭС.
Практическая значимость. Разработаны методы концентрирования и очистки культурального вируса ТГЭС штамм ВН-96. Апробирован эффективный способ деконтаминации линии клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) при помощи моно- и комбинации препаратов на основе ЭнрофлонаК и поверхностно-активных веществ. Определена оптимальная схема деконтаминации ПЛК сублинии СПЭВ-б от микоплазм. Подготовлены для практического использования очищенные от микоплазм-контаминантов эталонный и рабочий криобанки ПЛК сублинии клеток СПЭВ-б со стабильными культуральными и цитометрическими показателями. Определены оптимальные условия культивирования вируса ТГЭС в ПЛК сублинии СПЭВ-б стационарным и роллерным методами. Предложена защитная среда оптимального состава, разработаны режимы лиофилизации и условия хранения сухих форм культурального вируса ТГЭС.
По материалам диссертационной работы опубликованы «Методические рекомендации о порядке аттестации и поддержания перевиваемых линий клеток, используемых для культивирования вирусов и производства иммунобиологических препаратов ветеринарного назначения» (в соавторстве с Л. П. Дьяконовым, В. П. Уласовым, Б. В. Соловьевым, 2007), утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН А.М. Смирновым от 19.10.2007г.
Основные положения, выносимые на защиту
1. На основании определения размеров и морфологии частиц, изучения физико-химических свойств, электрофоретической подвижности и молекулярной массы структурных белков, антигенных и иммуногенных свойств подтверждена подлинность и специфичность штамма ВН-96 вируса ТГЭС.
2. Перевиваемая линия клеток СПЭВ-б наиболее чувствительна к штамму ВН-96 вируса ТГЭС.
3. Эффективная деконтаминация линии клеток почки эмбриона свиньи от микоплазменной инфекции достигается при использовании энрофлона-К и комбинаций препаратов норфлоксацина с этонием и энрофлона-К с твином-80.
4. Оптимальными условиями для выращивания линии клеток СПЭВ-б и репродукции штамма ВН-96 вируса ТГЭС являются: посевная концентрация клеток 150 тыс./мл, заражение в суспензию в дозе 5,0-6,0 lg ТЦД50, время адсорбции вируса клетками не менее 60 минут при 37єС, применение фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота и культивирование вируса роллерным методом.
5. Для замораживания и лиофилизации штамма ВН-96 вируса ТГЭС в биотехнологическом процессе эффективно использование защитной среды ВГНКИ-3.
Работа выполнена в лаборатории бактериальных и вирусных инфекций ГНУ Саратовского научно исследовательского ветеринарного института Россельхозакадемии по научно-исследовательской теме: «Усовершенствовать средства и методы защиты поросят от вирусных инфекций» (№ рег. ВНТИЦ 01200607301) в рамках программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития АПК РФ.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на: Международной научно-производственной конференции «Экологобиологические проблемы повышения продуктивного долголетия животных» (Екатеринбург, 2006 г.); Международной научно-практической конференции «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных» (Покров, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы, задачи и пути научного обеспечения приоритетного национального проекта «Развитие АПК» (Новочеркасск, 2008).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы, методы, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов, практических предложений, списка литературы. Список литературы включает 218 источников, в том числе 136 отечественных и 82 зарубежных. Работа иллюстрирована 27 таблицами и 12 рисунками.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы и методы
В работе использовали: штаммы вируса ТГЭС: штамм «ТО36SD192» (Япония) с титром 8,0 lgТЦД50/мл, полученный из коллекции микроорганизмов Всесоюзного института экспериментальной ветеринарии (ВИЭВ) в 1973 г; штамм «РИМС», полученный из сухой лиофилизированной вакцины РИМС (ГДР); штамм ВН-96 с титром 6,5-7,5 lgТЦД50/мл выделен из вакцинного штамма «РИМС» (методом предельных разведений с последующим 5-кратным клонированием микробляшек) на перевиваемой культуре СПЭВ (крупнобляшечный вариант).
В качестве материала для исследований использовали:
- трофоварианты линии клеток почки эмбриона свиньи, полученные из Всероссийского государственного НИИ контроля, стандартизации и сертификации (ВГНКИ) ветпрепаратов (СПЭВ, 305 пассаж) и из Всероссийского научно-иследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии (ВНИИВВ и М) (СПЭВ, 184 пассаж), которые пассировали стационарным и роллерным методами в соответствии с требованиями паспорта. Для различия трофовариантов линии клеток СПЭВ, сохраняемые в ВГНКИ ветпрепаратов (305 пассаж), были обозначены как СПЭВ-а, а линии клеток СПЭВ, сохраняемые в ВНИИВВ и М (184 пассаж), как СПЭВ-б. Эффективность пассирования перевиваемых линий оценивали по урожаю клеток (УК), индексу пролиферации (ИП) и морфологии клеток в культуре;
- питательные среды: «199», «Игла МЕМ», «Игла ДМЕМ», 0, 2% раствор версена, фосфатно-буферный раствор (ФБР) с рН 7,2-7,4; 0,25% раствор трипсина (ФС 42-3321-96); L-глутамин сухой (ТУ 6-09-16-1426-87); сыворотки крови (СК) плодов коров (ФС 42-3368-97) и крупного рогатого скота (ВФС 42-268ВС-90) в концентрации 5-10%;
- фторхинолоны (ФХЛ): в качестве антимикоплазменных средств испытывали энрофлон-К (ТУ 934342-016-47611900-00), изготовленный на основе энрофлоксацина в дозе 10 мкг/мл и 2 комплексных препаратов на основе норфлоксацина (50 мкг/мл) и энрофлона-К (35 мкг/мл) с поверхностно-активными веществами (ПАВ) - этонием и Тween-80 (SERVA 374775) в дозе 7 мкг/мл.
При проведении экспериментальных исследований использовали лабораторных и сельскохозяйственных животных: 16 кроликов (2-2,5 кг), 28 белых крыс (170-200 г), 35 новорожденных поросят, 50 свиней разных возрастных групп.
Индикацию микоплазм в клеточных культурах проводили микробиологическим методом в соответствии с Методическими рекомендациями по выделению, культивированию и идентификации микоплазм, ахолеоплазм и уреаплазм (1983), а также цитохимическим методом (ЦХМ) контроля, основанном на окраске ДНК клеток микоплазм флюорохромами: оливомицином или Hoechst-33258 (Методические рекомендаций по способу выявления микоплазм в культурах перевиваемых клеток, 1983). Индикацию микоплазм культур клеток в полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводили на базе ВГНКИ ветпрепаратов совместно с д.б.н. И.Л. Обуховым в соответствии с требованиями Методических указаний по диагностике возбудителей микоплазмоза методом полимеразной цепной реакции (1997).
Для очистки ПЛК от микоплазменной инфекции использовали различные препараты на основе ФХЛ. Схема деконтаминации тест-культур предусматривала внесение антимикоплазменных препаратов в суспензию изолированных клеток в течение 10 пассажей. Результативность деконтаминации ПЛК от микоплазм оценивали по ростовым свойствам, морфологии клеток в культуре, индексу пролиферации (ИП) и результатам цитохимического метода (ЦХМ) и полимеразно цепной реакции.
Чувствительность деконтаминированных и исходных (контроль) линий клеток СПЭВ к вирусу ТГЭС оценивали в течение 3 пассажей. Доза и способ заражения (в суспензию клеток и на монослой), условия и длительность культивирования вируса были оптимальными. Уровень накопления вируса оценивали микрометодом на плашках и выражали в lg ТЦД50/мл. Активность вируса оценивали по методу Рида и Менча.
ПЛК сублиний СПЭВ-а и СПЭВ-б выращивали в стационарных условиях на покровных стеклах в пробирках в соответствии с требованиями паспорта. Цитометрическое исследование проводили на лазерном проточном цитофлуориметре-сортере EPICSR «Elite» (Coulter, USA), оборудованном аргоновым лазером CYONICS (Uniphase, USA) с длиной волны возбуждения 488 нм и мощностью луча 15 mBт. Полученные гистограммы подвергали математической обработке с использованием программ EXPO32 (Beckman-Coulter, USA) и Multi Cyce (Phoenix Flow Systems, USA).