Автореферат: Биологическая характеристика штамма ВН-96 вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней и разработка биотехнологических параметров его культивирования

Тест-культуры инфицировали штаммом ВН-96 вируса ТГЭС в дозе 4,0 lg ТЦД₅₀ через 72 часа культивирования. Фиксацию и окрашивание опытных и контрольных культур осуществляли через 3, 4 и 5 суток после заражения. Покровные стекла извлекали из пробирок, отмывали физиологическим раствором, фиксировали в растворе Буэна два часа при комнатной температуре, отмывали 70%-ным этанолом в течение суток и окрашивали смесью азура с эозином по Романовскому. Препараты изучали в световом микроскопе и фотографировали при увеличении 32Ч10 с зеленым фильтром на пленку «Микрат-300».

Для изучения бляшкообразующей способности штамма ВН-96 по методу С. Д. Дальбекко и А. М. Фоггота (1954) использовали перевиваемую линию клеток СПЭВ, выращенной в пластиковых матрасах объемом 25 см². Наблюдение за появлением бляшек осуществляли ежедневно с 3 по 7 сутки. Подсчет, оценку величины и формы бляшек проводили на светлом фоне. Электронно-микроскопический анализ вируса ТГЭС проводили по методике А.П. Пономарева с помощью электронного микроскопа JEM-100В (Jeol, Япония) при увеличении Ч 245000.

Концентрирование культурального вируса ТГЭС проводили центрифугированием в градиенте сахарозы по методу C.M. Horzinek (1982). Полученную суспензию очищенного вируса использовали для анализа белков при помощи электрофореза в додецилсульфат натрия полиакриламидном геле (ДСН-ПААГ) при постоянном напряжении 80В в течение 20 мин и в дальнейшем при напряжении 200В в течение 3-х часов. Результаты разделения протеинов на электрофореграмме обрабатывали с помощью программы Gel-Imager, пакета программы Gel explorer версия 1,0 (ДНК-технология, Москва).

Оценку идентичности генома вируса ТГЭС из очищенного и сконцентрированного материала проводили с помощью ПЦР. Выделяли РНК вируса ТГЭС с использованием коммерческого набора с суспензионным силикатным сорбентом NucleoS+TM (Биоком, г. Москва) согласно инструкции производства препарата. Результаты ПЦР документировали на трансиллюминаторе, оснащенным видеосистемой DNA-analyzer.

Лиофилизацию штамма ВН-96 вируса ТГЭС 5-го пассажа с активностью 6,5 lgТЦД₅₀/мл проводили в ампулах ШПВ-6 в «Лаборатории инструментальных методов контроля» ФГУ ВГНКИ на установке LIOVAK GT-2. В качестве защитных сред (ЗС) использовали обезжиренное молоко (ОМ), среду ВГНКИ-3 и среду ЛС-18. В контроле лиофилизацию штамма ВН-96 вируса ТГЭС проводили без стабилизатора.

Для иммунизации крыс и кроликов использовали штаммы вируса ТГЭС ВН-96 и «ТО₃₆SD₁₉₂» и инактивированную вакцину ЧССР. Активность сывороток крови оценивали в реакции нейтрализации (РМН), проводимой по Методике выявления антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней в реакции нейтрализации на микропанелях (2000).

Проверку антигенной и биологической активности штамма ВН-96 вируса ТГЭС проводили на 12 подсвинках, серонегативных по отношению к ТГЭС. Перед введением и через 22 дня после инъекции вируса сыворотки крови животных исследовали в РМН на наличие антител к вирусу ТГЭС. За животными проводили ежедневное наблюдение, а первые 3 дня после введения вируса проводили термометрию. Исследование биологической активности и стабильности штамма ВН-96 вируса ТГЭС проводили путем титрования в РМН и последовательного 7-ми кратного пассирования на перевиваемой линии клеток СПЭВ. в культуре клеток СПЭВ. Исходный вирус и культуры 3, 5 и 7 пассажей титровали в планшетах в 3-кратной повторности.

Достоверность результатов подтверждали путём статистической обработки результатов по общепринятым методикам и определения различий средних значений с помощью критерия Стьюдента. Результаты считали достоверными при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение и биологическая характеристика штамма ВН-96 вируса ТГЭС

На предварительном этапе нашей работы сравнительное изучение пригодности линии клеток СПЭВ для контроля специфической активности вируса ТГЭС проводилось с использованием штамма «РИМС». Активность образцов этого штамма вируса ТГЭС по ЦПД и методом бляшек была сопоставимой и достигала, соответственно, 6,22±0,07 lg ТЦД₅₀/мл и 6,06±0,23Ч10⁶ БОЭ/мл. Под агаровым покрытием клетки монослоя равномерно окрашивались и сохраняли жизнеспособность в течение 8-9 суток, затем наблюдался их частичный лизис, достигающий максимума к 10-12 дню после заражения. Бляшки округлой формы различного размера выявлялись с 4-суток наблюдения и достигали максимальной величины на 6-7 сутки (рис. 1).

Рис. 1. Бляшки, образуемые в монослое ПЛК СПЭВ штаммом ВН-96 вируса ТГЭС: К - контроль ПЛК, 4,5-опытные образцы ПЛК

Сравнительное изучение физико-химических свойств штамма ВН-96 вируса ТГЭС

Для электронно-микроскопического анализа выделенного варианта ВН-96 вируса ТГЭС использовали метод негативного контрастирования. Установлен диаметр вирионов на уровне 144,8±7,2 нм. При измерении вирионов в окрашенных фосфо-вольфрамовой кислотой препаратах были обнаружены плеоморфные, оболочечные вирионы со слоем булавовидных отростков (пепломеров) в виде короны длиной 12-20 нм. В суспензии присутствовали преимущественно неповрежденные вирусные частицы (более 90%). Количество дефектных частиц было невелико (рис.2)..

Рис. 2. Электронная микрофотография сконцентрированного препарата штамма ВН-96 вируса ТГЭС ( Ч 245000)

Сравнительный анализ размеров и морфологической характеристики частиц свидетельствовал о том, что они соответствуют вирусу рода Coronavirus животных. Нами был проведен анализ структурных белков штамма ВН-96 вируса ТГЭС методом электрофореза в ДСН-ПААГе и получена электрофореграмма с достаточным разделением белковых фракций маркера и вируса ТГЭС, что позволило сделать вывод о достаточно высокой концентрации вирусных белков в пробе после стандартной окраски геля красителем КУМАССИ-G850. Анализ молекулярных масс выявленных белков показал, что они специфичны для вируса ТГЭС.

Были выявлены: белок P (крупный поверхностный гликопротеин S) с молекулярной массой 170-200 кДа; белок N (основной нуклеокапсидный протеин) с молекулярной массой 50-62 кДа и белок М (матриксный мембранный протеин) с молекулярной массой 25-35 кДа (рис. 3).

В треке вирусных протеинов отмечено наличие фракции 15-17 кДа. По данным Wesley R.D. и Woods R.D. (1986) такую же величину имеет негликолизируемый протеин 17кДа (17К), который принадлежит структурному белку вируса ТГЭС. Следовательно, было достигнуто разделение всех известных белков вируса ТГЭС. Для идентификации нуклеиновой кислоты вируса ТГЭС нами была испытана технология изготовления тест-системы для ПЦР с использованием специфического праймера - консервативного участка генома S вируса ТГЭС, содержащего 886 пар нуклеотидов (пн).

Рис. 3. Электрофореграмма структурных белков очищенного и сконцентрированного препарата штамма ВН-96 вируса ТГЭС

Примечание: ВТГС - трек структурных белков ТГЭС, Маркер - трек молекулярного белкового маркера“Precision plus protein standards AllBlue”.

Результаты испытаний показали, что эта методика позволяет достоверно судить о наличии в концентрированном и очищенном образце генома вируса ТГЭС. На полученной электрофореграмме продуктов ПЦР в агарозном геле было достигнуто достаточно высокое разделение ДНК-маркера (DNA-Ladder 100) и комплементарной ДНК (кДНК) антигена вируса ТГЭС. В треках вирусной нуклеиновой кислоты выявлена единственная характерная фракция специфического продукта ПЦР (кДНК величиной 886 пн), свидетельствующая о наличии генома вируса ТГЭС в исследованной пробе (рис. 4).

Рис. 4. Электрофореграмма продуктов ПЦР кДНК, полученной из концентрированного препарата штамма ВН-96 вируса ТГЭС

Примечание: К (-) - отрицательный контроль ПЦР; ВТГС - трек продуктов ПЦР кДНК препарата концентрированного ТГЭС; М - трек молекулярного ДНК-маркера “DNA-Ladder 100”.

Сравнительная оценка чувствительности перевиваемых сублиний клеток почки эмбриона свиньи к вирусу ТГЭС

Нами были изучены на пригодность для использования в биотехнологии получения антигенного препарата вируса ТГЭС ПЛК сублиний СПЭВ-а и СПЭВ-б. Установлено, что клетки сублинии СПЭВ-б существенно отличаются in-vitro от сублинии СПЭВ-а по уровню адгезии, морфологическим показателям и ростовым свойствам. Клетки сублинии СПЭВ-а были зернистыми, рисунок монослоя слабо выражен, к концу периода роста в культуре отмечали дегенеративные изменения, а в культуральной жидкости - округлые апоптозные тельца, количество которых в процессе длительного культивирования возрастало.

Клетки сублинии СПЭВ-б, после хранения в жидком азоте в течение 30 лет, имели, по тесту витального окрашивания трипановым синим, жизнеспособность на уровне 82-86%,. При этом они сохранили свои адгезивные свойства и, в течение трех пассажей (общий 178-ой пассаж), полностью восстановили ростовые характеристики. На третьи сутки культивирования формировался конфлюэнтный клеточный монослой, цитоплазма клеток была мелкозернистая и вакуолизирована незначительно, ядерный хроматин равномерно распределен по всей кариоплазме. Изредка в монослое встречались гигантские и двуядерные клетки, местами отмечены интенсивно окрашенные участки монослоя, состоящие из клеток, растущих в несколько слоев (фокусы многослойного роста). На фоне нормальных митозов достаточно часто встречались неправильные - с отставанием хромосом в метафазе - 3-х и 4-х полюсные митозы.

При заражении ПЛК СПЭВ штаммом ВН-96 вируса ТГЭС было установлено, что более высокочувствительной тест-культурой является сублиния клеток СПЭВ-б, в которой вирус репродуцируется более интенсивно и накапливается в максимальных титрах 7,0-7,5 lg ТЦД₅₀/мл. Сублиния клеток СПЭВ-а оказалась менее чувствительной культуральной моделью для размножения вируса, т.к. накопление вируса в пассажах было на 0,5 lg ТЦД₅₀/мл ниже и не превышало 7,0 lg ТЦД₅₀/мл.

Стандартизация перевиваемых сублиний клеток СПЭВ - субстратов для производства штамма ВН-96 вируса ТГЭС

В процессе биотехнологического производства антигена вируса очень важен этап контроля ПЛК на микоплазменную контаминацию. В нашей работе для индикации микоплазм в культурах сублиний клеток СПЭВ-а и СПЭВ-б параллельно использовали микробиологический и цитохимический методы контроля, а также ПЦР.Анализ полученных результатов показал, что микоплазменная инфекция сублиний клеток СПЭВ установлена в обеих тест-культурах как в ПЦР, так и ЦХМ, который пригоден для предварительного контроля и оценки уровня инфицированности клеточных культур микоплазмами. Микробиологический метод контроля оказался не эффективным (табл. 1).

селекция штамм вирус

Таблица 1- Сравнительная оценка чувствительности методов индикации микоплазм - контаминантов в первичной и перевиваемых культурах клеток

Примечание: (-) - отрицательный результат; (+) - положительный результат контроля.

Далее были решены вопросы деконтаминации сублиний клеток СПЭВ от микоплазм-контаминантов при помощи моно- и комплексных препаратов на основе фторхинолонов. Установлено, что энрофлон-К в оптимальной дозе является достаточно активным в отношении микоплазм-контаминантов и умеренно-токсичным для сублиний клеток СПЭВ. Применение препарата по методу Mowles (1988) в течение 10 пассажей позволило очистить культуры клеток от микоплазменной инфекции благодаря оптимальному соотношению дозы ФХЛ, концентрации клеток и уровня инфицированности микоплазмами клеток в культурах.

Комбинации препаратов на основе фторхинолонов и ПАВ также характеризовались выраженными антимикоплазменными свойствами и обеспечили деконтаминацию сублинии клеток СПЭВ-б от контаминанта в течение первых 5 пассажей.

Препарат на основе норфлоксацина (50 мкг/мл) и этония (7,0) даже в более высокой концентрации оказался менее токсичным и вызывал лишь незначительные цитоморфологические изменения сублинии клеток СПЭВ-б, а последующее восстановление культуральных и морфологических показателей происходило в более короткие сроки (рис. 5).

Рис. 5. Перевиваемая линия клеток СПЭВ: а - чистая культура СПЭВ; б - разрушение культуры СПЭВ микоплазмами (начальная стадия), появление «окон» по стрелке; в - инфицированная микоплазмами культура СПЭВ; г - культура СПЭВ после деконтаминации Энрофлоном-К

Последующее 10-ти кратное пассирование культуры клеток с контрольным набором антибиотиков не изменило положительного результата. Достоверность деконтаминации образцов субкультур СПЭВ была подтверждена ЦХМ и в ПЦР.