Автореферат: Биологическая характеристика штамма ВН-96 вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней и разработка биотехнологических параметров его культивирования

Таблица 5 - Стабильность штамма ВН-96 вируса ТГЭС, высушенного с различными защитными средами при температуре 20±2є С

При температуре минус 20є С в течение 2-х лет музейного хранения (срок наблюдения) препарат практически сохранил исходную активность вируса. При 4-8є С сухой препарат также сохранял стабильность, и лишь через 18-24 мес. хранения потери активности вируса достигали 1,0 lg ТЦД₅₀/мл.

Таким образом, в результате сравнительных исследований для практического использования были предложены защитная среда ВГНКИ-3 и оптимальные режимы высушивания полуфабриката, обеспечивающие сохранность вируса ТГЭС не менее 2-х лет хранения, как в замороженном состоянии, так и в условиях бытового холодильника.

Изучение антигенных свойств штамма ВН-96 вируса ТГЭС

Для доказательства возможности применения штамма ВН-96 вируса ТГЭС в культуре клеток СПЭВ-б для изготовления нативных и лиофилизированных образцов антигенов против ТГЭС нами были проведены сравнительные исследования по оценке его антигенных свойств, штамма «ТО₃₆SD₁₉₂» и вакцины производства ЧССР.

Установлено, что на 30-й день после иммунизации всеми испытуемыми штаммами вируса ТГЭС в сыворотках крови белых беспородных крыс были выявлены специфические вируснейтрализующие антитела при постановке реакции нейтрализации (РН). При этом, в сыворотке крови крыс при введении штамма ВН-96 антитела определялись в разведении 1/128 и при введении вакцины ЧССР - 1/256, что было выше значений для сыворотки крови крыс при введении штамма «ТО₃₆SD₁₉₂».

Полученные результаты позволили провести дальнейшие сравнительные исследования антигенных свойств штамма ВН-96 и вакцины производства ЧССР на кроликах. Выявлены специфические вируснейтрализующие антитела в РН при разведении сывороток крови 1/512, что подтвердило одинаково высокую антигеную активность этих штаммов.

На следующем этапе исследований антигенную активность штамма ВН-96 определяли на 12 серонегативных по отношению к ТГЭС подсвинках. За животными проводили ежедневные наблюдения, а первые три дня после введения вируса измеряли температуру тела. Клинические наблюдения за иммунизированными животными не выявили у поросят каких-либо отклонений в их состоянии; животные оставались клинически здоровыми на протяжении всего срока наблюдений. Через 22 дня после иммунизации все подсвинки стали сероположительными, титры специфических антител определялись на уровне 4,5-7,0 log₂ против штамма «Ленинградский» и 5,5-7,5 log₂ против штамма ВН-96.

Исследование биологической активности штамма ВН-96 вируса ТГЭС изучали с помощью проведения 7 последовательных пассажей на культуре клеток СПЭВ. Исходный титр вируса составлял 5,250,25 lg ТЦД₅₀/см³. На 3-ем пассаже титр вирус составлял 5,750,31 lg ТЦД₅₀/см³, а к 5-му пассажу вирус накапливался в максимальных титрах и составлял 7,000,51 lg ТЦД₅₀/см³.В то же время дальнейшее пассирование не привело к повышению титра ТГЭС штамма ВН-96.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что выделенный штамм ВН-96 вируса ТГЭС обладает выраженными антигенными свойствами и высокой биологической активностью. Данный факт позволил сделать вывод о перспективности его использования для конструирования вакцины.

Сравнительная оценка иммунобиологических свойств штамма ВН-96 вируса ТГЭС в условиях свиноводческого комплекса

Для оценки вирулентности штамма ВН-96 вируса ТГЭС использовали 15 однодневных поросят, полученных от серонегативных по ТГЭС свиноматок. Предварительно сухой препарат в ампулах разводили физраствором и вводили перорально (п/о) в объёме 5 мл/гол., содержащем вируса 10⁵ lg ТЦД₅₀. Пяти контрольным животным препарат не вводили и содержали их отдельно при температуре 32-35 °С. Клинические признаки ТГЭС (температурная реакция, диарея, рвота, мышечная дрожь и конвульсии) и других вирусных инфекций (классической чумы свиней, болезни Ауески, РРС, везикулярной болезни, энтеро-, парво- и аденовирусов) отсутствовали. Гибели поросят в течение срока наблюдения (20 суток) не отмечено. Следовательно, штамм ВН-96 вируса ТГЭС является авирулентным, не вызывает поствакцинальных осложнений и гибели животных.

Реверсибельность аттенуированного штамма ВН-96 вируса ТГЭС оценивали на новорожденных безмолозивных поросятах в течение 5 пассажей. Для каждого пассажа штамма использовали по 5 поросят. В первом пассаже для интраназального заражения животных использовали исходный штамм в дозе 2Ч10^6,5 lg ТЦД₅₀. Через 2-3 суток 2-х поросят из 5-ти забивали. Из тканей тонкого отдела кишечника, лёгких и лимфоузлов готовили 10 % суспензию, которую осветляли центрифугированием, добавляли антибиотики и в качестве исходного материала в объёме 5 мл использовали для интраназального заражения (2-ой пассаж) поросят, а также для вирусвыделения на культуре клеток СПЭВ. Аналогичным образом проводили 3-5 пассажи. После каждого пассажа 3 оставшихся вакцинированных поросят выдерживали в течение 10 суток и оценивали общее состояние животных по клиническим признакам. Проведённые исследования показали, что штамм ВН-96 сохраняет исходные биологические свойства в течение 5 пассажей.

Иммуногенность штамма ВН-96 оценивали на 25 дневных поросятах, полученных от серонегативных по ТГЭС свиноматок. Опытных поросят (15 голов) однократно внутримышечно вакцинировали штаммом ВН-96 в дозе 4,2 lg ТЦД₅₀. Контрольных поросят (10 голов) не вакцинировали и содержали отдельно при температуре 32-35°С. Через 10 дней после введения вируса отбирали пробы крови. Полученные сыворотки исследовали в РМН на наличие специфических антител. Результаты исследований показали, что штамм ВН-96 вируса ТГЭС обеспечивает синтез вируснейтрализующих антител в организме привитых поросят, определяемых в сыворотке крови в титре 2,11±0,39 log₂, и 100% сохранность вакцинированных поросят.

Таким образом, проведенные исследования позволили выделить и охарактеризовать биологические свойства штамма ВН-96 вируса ТГЭС, которые сохраняются в течение 5 пассажей. Доказано, что штамм ВН-96 является безвредным и авирулентным для лабораторных животных и поросят, генетически стабилен в процессе серийного пассирования, характеризуется выраженными антигенными и иммуногенными свойствами, что позволяет рекомендовать его для конструирования вакцины против вируса ТГЭС. Отработаны биотехнологические параметры культивирования штамма ВН-96 вируса ТГЭС, использования и деконтаминации ПЛК СПЭВ, обоснованы используемые питательные среды и ростовые добавки, оптимальные режимы замораживания и лиофилизации культурального вируса ТГЭС, рекомендованные к практическому использованию.

Выводы

1. Показано, что по размерам и морфологии частиц, электрофоретической подвижности и молекулярной массе структурных белков, по наличию в треках ПЦР вирусной нуклеиновой кислоты характерной фракции комплементарной ДНК (кДНК) величиной 886 пар нуклеотидов вирионы штамма ВН-96 соответствуют показателям коронавируса свиней. Специфичность штамма ВН-96 подтверждена в реакции нейтрализации со специфической сывороткой крови и в ПЦР.

2. Установлена различная чувствительность первичной культуры клеток почек эмбриона поросят и перевиваемых сублиний клеток СПЭВ к штамму ВН-96 вируса ТГЭС. Наиболее чувствительной и перспективной культуральной моделью для практического применения является ПЛК сублинии СПЭВ-б.

3. Выявлено, что деконтаминация линии клеток СПЭВ в максимальных концентрациях, не превышающих 40-50 тыс./мл, от микоплазменной инфекции наиболее успешна при использовании моно-препарата на основе энрофлона-К по методу Мовлеса и двух комбинированных препаратов: норфлоксацин (50мг/мл) + этоний (7мкг/мл) и энрофлон-К (35 мкг/мл) + твин-80 (7мкг/мл).

4. Определена целесообразность применения метода проточной цитометрии для экспресс-оценки и выбора наиболее перспективной культуральной модели для производства антигена и контроля активности вакцины против ТГЭ свиней. Установлена обратная зависимость ростовых свойств и величины апоптоза сублинии клеток СПЭВ-б.

5. Максимальное накопление вируса (6,67-7,33 lg ТЦД₅₀/мл) происходит при посевной концентрации ПЛК сублинии клеток СПЭВ-б 150тыс/мл, заражении в суспензию клеток ПЛК штамма ВН-96 вируса ТГЭС из расчета 5,0 lg ТЦД₅₀/мл, адсорбции вируса клетками в течение 60 минут при 37С. Оптимальной ростовой питательной средой является среда «Игла МЕМ» с 2-4% фетальной сывороткой крови; накопление вируса роллерным методом достоверно выше на 0,7-1,0 lg ТЦД₅₀/мл, чем в стационарной культуре.

6. Определена эффективная защитная среда - ВГНКИ-3, в которой лиофильно высушенный штамма ВН-96 сохраняет безвредность для лабораторных животных и исходную активность не менее двух лет, при температуре хранения 4-6є и минус 20єС.

7. Штамм ВН-96 вируса ТГЭС обладает безвредностью, авирулентностью для лабораторных животных и поросят, сохраняет исходные биологические свойства в течение 5-и пассажей, генетически стабилен в процессе серийного пассирования, характеризуется выраженными антигенными и иммуногенными свойствами, что позволяет использовать его для конструирования вакцины против вируса ТГЭС.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Методические рекомендации о порядке аттестации и поддержания перевиваемых линий клеток, используемых для культивирования вирусов и производства иммунобиологических препаратов ветеринарного назначения // Дьяконов Л. П., Уласов В. Н., Соловьев Б. Н., Симоненко Н. В. и др. - М. - 2006 г.

2. Методические указания по поддерживанию, хранению и контролю линии клеток «СПЭВ-б», утвержденные ФГУ ВГНКИ от 6 апреля 2007 г.

3. Для деконтаминации линии клеток СПЭВ от микоплазменной инфекции рекомендуется использовать моно-препарат на основе энрофлона-К и два комбинированных препарата на основе норфлоксацина с этонием и энрофлон-К с твином-80. Максимальные концентрации обрабатываемых ПЛК не должны превышать 40-50 тыс./мл. Сыворотки крови, вносимые в питательную среду, необходимо предварительно обработать с профилактической целью энрофлоном-К в дозе 20 мкг/мл в течение 72 часов при 37є С.

4. Рекомендуется для экспресс-оценки и выбора наиболее перспективной культуральной модели для производства антигена использовать метод проточной цитометрии, при котором достигается быстрая оценка характеристик клеток по показателям: размеры клеток, гранулярность, распределение ДНК по фазам клеточного цикла и запрограммированная клеточная гибель - апоптоз.

5. Для лиофилизации штамма ВН-96 вируса ТГЭС предлагается применять защитную среду ВГНКИ-3, обеспечивающую его безвредность для лабораторных животных и сохранение исходной активности штамма не менее двух лет при температуре хранения 4-6є и минус 20є С.

6. Рекомендуется использовать штамм ВН-96 вируса ТГЭС в качестве производственного аттенуированного штамма для изготовления диагностических и иммунобиологических препаратов против трансмиссивного гастроэнтерита свиней.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дьяконов Л.П. Методические рекомендации о порядке аттестации и поддержания перевиваемых линий клеток, используемых для культивирования вирусов и производства иммунобиологических препаратов ветеринарного назначения/ Л.П. Дьяконов, В.П. Уласов, Б.В. Соловьев, Н.В. Симоненко // Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медицины. - Москва, 2006. - Ч. IV. - С. 422-439.

2. Ласкавый В.Н. Иммунофарм - эффективный иммуномодулятор для профилактики тансмиссивного гастроэнтерита свиней в неблагополучных хозяйствах / В.Н. Ласкавый, Н.В. Воронова (Симоненко), В.Т. Ночевный // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных: сб. тр. межд. науч.-практ. конф. - Покров, 2008. - С. 172-175.

3. Ласкавый В.Н. Стандартизация сублиний клеток почки эмбриона свиньи методом проточной цитометрии / В.Н. Ласкавый, Н.В. Воронова (Симоненко), С.Г. Юрков, Л.А. Яковлева, Б.В. Виолин, В.Т. Ночевный // Аграрная наука. - 2007. -№ 4. - С. 29-31.

4. Симоненко Н.В. Очистка линии клеток почки эмбриона свиньи от микоплазменной инфекции/ Н. В. Симоненко // Вестник Саратовского госуниверситета им. Н.И. Вавилова. - 2008. - № 2. - С. 53-55.

5. Симоненко Н.В. Оптимизация условий накопления вируса ТГЭ свиней в культуре перевиваемой линии клеток почки эмбриона свиньи / Н.В. Симоненко //Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики инфекционных болезней животных и птиц: сб. науч. тр. - Екатеринбург, 2008. - Вып. 2. - С. 92-95.

6. Симоненко Н.В. Стабилизация изолята «ВН-96» вируса ТГЭ свиней методом лиофильного высушивания/ Н.В. Симоненко // Проблемы, задачи и пути научного обеспечения приоритетного национального проекта «Развитие АПК»: сб. материалов Всерос. науч.-практ. конф. - Новочеркасск, 2008. - С. 57-60.

7. Симоненко Н.В. Изучение физико-химических и иммунобиологических свойств штамма ВН-96 вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней / Н.В. Симоненко, В.Н. Ласкавый, В.Т. Ночевный // Аграрная наука. - 2010. - № 11. - С. 30-32.