Автореферат: Биологическая характеристика штамма ВН-96 вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней и разработка биотехнологических параметров его культивирования

Свободные от микоплазм-контаминантов сублинии клеток СПЭВ-а и СПЭВ-б обладали выраженными ростовыми свойствами и в процессе серийного пассирования сохраняли исходную морфологическую структуру монослоя без признаков дегенерации клеток в культуре. Деконтаминированные от микоплазменной инфекции культуральные модели были размножены в стационарных условиях в соответствии с требованиями паспорта. Повторный контроль в ПЦР не выявил микоплазменной инфекции в образцах деконтаминированных сублиний клеток, сохраняемых в банке в жидком азоте.

Для анализа и стандартизации наиболее перспективных для практики линий клеток ряд авторов рекомендовали метод проточной цитометрии (ПЦ) (Полетаев, 1989; Ночевный и др. 2003). В нашей работе была проведена оценка пригодности и перспективности использования ПЦ для анализа трофовариантов линий клеток СПЭВ-а и СПЭВ-б по следующим показателям: размерам клеток, гранулярности, распределению ДНК по фазам клеточного цикла и запрограммированной клеточной гибели - апоптозу.

Анализ клеток СПЭВ-а и СПЭВ-б с использованием малоугольного и 90є светорассеивания показал, что исходные образцы суспензий содержат соответственно 42,8 и 52,65 % пролиферирующих клеток, а также конгломераты, состоящие из 2-3 и более клеток. Отмечено также, что трофоварианты линии клеток СПЭВ-а, прошедшие дополнительно 111 пассажей, увеличились в среднем на 15% и достигли среднестатических размеров 18,87±2,11 мкм. В тоже время клетки линии СПЭВ-б, сохраняемые в криобанке с 1972 г., состояли из прозрачных, мелкозернистых, эпителиоподобных клеток размером не более 15,0±2,50 мкм (табл. 2).

Таблица 2 - Сравнительная характеристика культуральных и цитометрических показателей трофовариантов ПЛК СПЭВ

Культуральные свойства

Цитометрические показатели

По показателю гранулярности исследуемые сублинии клеток СПЭВ заметно отличаются друг от друга, что подтверждают показатели МЕАМ для клеток сублинии СПЭВ-а на уровне 461 и для сублинии СПЭВ-б в пределах 379. Следует также отметить, что увеличение размеров и гранулярности клеток сублинии СПЭВ-а происходит параллельно в результате неадекватных условий и длительности пассирования клеток in-vitro.

Результаты сравнительного изучения распределения ДНК по фазам клеточного цикла ПЛК СПЭВ, прошедших различное количество пассажей, показали, что культура СПЭВ-б оказалась более перспективной для практики, чем сублиния СПЭВ-а. Это заключение обосновано тем, что клетки СПЭВ-б интенсивно пролиферируют (ИП4-6) in vitro, а показатель G2/G1 равный 1,917 характерен для нормально растущей культуры и указывает на отсутствие в популяции аномальных клеток с измененным количеством ДНК. Анализ гистограмм распределения клеток в зависимости от содержания ДНК показал, что для линий клеток СПЭВ-б показатель апоптоза был в 11,6 раза ниже, чем в культуре клеток СПЭВ-а и не превышал 3,6%.

Полученные данные, а также высокие ростовые свойства и удовлетворительные показатели клеточного цикла дают основание рекомендовать в качестве наиболее перспективного клеточного субстрата ПЛК СПЭВ-б, как для производства антигена, так и для контроля активности вируса ТГЭС. Напротив, длительное пассирование сублинии клеток СПЭВ-а и неудовлетворительные показатели клеточного цикла привели к значительному приросту (41,8%) апоптотических клеток. Эти факты говорят о старении и практической непригодности данной культуральной модели.

Таким образом, в результате исследований в качестве тканевого субстрата нами предложена перевиваемая сублиния клеток СПЭВ-б, характеризующаяся высоким ростовым потенциалом, оптимальными показателями ПЦ, нормальной морфологией и высокой чувствительностью к вирусу ТГЭС.Экспериментально подтверждена коррелятивная зависимость величины апоптоза и качества тест-культуры.

Этот факт указывает на возможность и перспективность использования достаточно экономичного метода ПЦ для экспресс-оценки, выбора и стандартизации образцов ПЛК гомологичного вида, но сохраняемых в российских и международных криобанках, а также позволяет рассматривать апоптоз в качестве объективного, практически значимого показателя, при выборе наиболее перспективного клеточного субстрата, отвечающего требованиям ВОЗ, как для целей диагностики, так и производства вакцин.

Оптимизация условий культивирования вируса ТГЭС в перевиваемой сублинии клеток почки эмбриона свиньи СПЭВ-б

На следующем этапе работы была решена задача разработки оптимальных условий культивирования вируса ТГЭС штамма ВН-96 и штамма ТО₃₆SD₁₉₂ в стационарных и роллерных культурах клеток СПЭВ в зависимости от факторов внешней среды.

Анализ полученных данных показал, что для получения максимальных титров штамма ВН-96 вируса ТГЭС оптимальными являются значения следующих факторов: посевная концентрация клеток 150 тыс./мл, заражение в суспензию в дозе 5,0-6,0 lg ТЦД₅₀, время адсорбции вируса клетками не менее 60 минут при 37єС, применение фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота и культивирование вируса роллерным методом.Эти показатели являются наиболее существенными, взаимозависимыми и определяющими, в итоге, уровень накопления вируса ТГЭС. В указанных условиях накопление штамма ВН-96 вируса ТГЭС достигал 6,5-7,5 и даже 8,0 lg ТЦД₅₀/мл, что было подтверждено в экспериментальных условиях и, в последующем, в условиях производства (табл. 3).

Таблица 3 - Влияние дозы заражения на уровень накопления штамма ВН-96 вируса ТГЭС в сублинии клеток СПЭВ-б

Примечание: * - срок максимального накопления вируса (сутки).

Серийное пассирование штамма ВН-96 вируса ТГЭС в перевиваемой сублинии клеток СПЭВ-б

Возможность и перспективность длительного пассирования штамма ВН-96 вируса ТГЭ в сублинии клеток СПЭВ-б оценивали в оптимальных условиях и сроках культивирования, соответствующих ранее установленным показателям. Полученные данные свидетельствуют о том, что сублиния клеток СПЭВ-б является достаточно чувствительным субстратом для серийного пассирования штамма ВН-96 вируса ТГЭ свиней. Параллельно оценивали характер цитоморфологических изменений в тест-культуре под воздействием вируса ТГЭС. Контрольная монослойная сублиния клеток СПЭВ-б была представлена прозрачными, мелкозернистыми, эпителиоподобными клетками полигональной формы, которые сохранялись без смены ростовой среды в течение 6-8 суток. Урожай клеток в монослойной культуре в 1 л матрасе достигал 35-40 млн.

В инфицированной сублинии клеток СПЭВ-б дегенеративные изменения под воздействием штамма ВН-96 обнаруживались через 36-48 часов после заражения. На 3-4 сутки наблюдения отмечается массовое округление клеток (круглоклеточная дегенерация) и их частичное отслоение от субстрата с образованием «окон». Ряд клеточных элементов сливаются в многоядерные симпласты.

Таким образом, в результате проведенных исследований для серийного пассирования вируса ТГЭС была предложена высокочувствительная, неконтаминированная сублиния клеток СПЭВ-б, обеспечивающая накопление штамма ВН-96 на уровне 7,0-7,33 lg ТЦД₅₀ в течение 10 пассажей.

Опытно-промышленное производство штамма ВН-96 вируса ТГЭС

Производство иммунобиологических препаратов требует выпуска больших объемов активных антигенов с минимальными затратами труда, средств и времени. Решение данной проблемы предполагает применение более эффективного и более производительного роллерного метода культивирования вирусов.

В проведенных нами экспериментах оценивали возможность и перспективность культивирования штамма ВН-96 вируса ТГЭС в сублинии клеток СПЭВ-б роллерным методом. Для этого использовали пластиковые роллерные бутыли объемом 2л (Rollerbottle Cellmaster) фирмы Greiner bio-one Weaton (USA). Скорость вращения бутыли составляла 12 об/час. В контрольных экспериментах вирус выращивали в стационарных условиях в пластиковых матрасах (Greiner) объемом 0,6 л. Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что культивирование вируса ТГЭС во вращающихся бутылях является более эффективным и производительным, чем метод стационарных культур (табл. 4).

Таблица 4 - Сравнительное культивирование штамма ВН-96 вируса ТГЭС

Примечание: ПКК - посевная концентрация клеток.

Во вращающихся сосудах отмечали практически 100%-ную адгезию клеток СПЭВ-б к поверхности субстрата, в контрольных - не более 90-95%, а монослойные культуры формировались на 24 часа раньше, чем в матрасах. Границы клеток и рисунок монослоя в роллерных культурах были более выраженными, зернистость отсутствовала. К 5 суткам наблюдения рН среды снижался с 7,4-7,6 до 6,9-7,1, за счет увеличения метаболической активности клеток в культуре.

Таким образом, роллерный метод культивирования обеспечивает оптимальные условия для репродукции штамма ВН-96 вируса ТГЭС в большей части клеточной популяции и накопление больших объемов антигена с активностью не ниже 7,33-7,5 lg ТЦД₅₀/мл. Стабильное изготовление стерильного антигена наиболее реально при использовании энрофлона-К, обладающего выраженными антибактериальными и антимикоплазменными свойствами, что особенно важно при крупномасштабном производстве ПЛК, вируссодержащих материалов и иммунобиологических препаратов.

Установление оптимальных параметров лиофильного высушивания культурального вируса ТГЭС

Установлено, что при стандартных условиях лиофильного высушивания культурального вируса ТГЭС практически равноценным защитным эффектом характеризовались стабилизаторы ВГНКИ-3 и ОМ. Визуальный контроль показал, что высушенные образцы штамма ВН-96 вируса ТГЭС представлены в форме аморфных «таблеток» светлых тонов, не содержат «кратеров» и «каверн», имеют форму нижней части ампул и легко отделяются от стекла при легком встряхивании.

Снижение активности в образцах вируса с оптимальными защитными средами в результате замораживания и лиофилизации составляло, соответственно, с ОМ 0,7-0,9 lg ТЦД₅₀/мл. Дальнейшие исследования по термоинактивации сухих образцов штамма ВН-96 вируса ТГЭС в течение года при 20±2є С и 37±0,5є С подтвердили равноценность (р<0,01) стабилизирующих свойств, защитных сред ВГНКИ-3 и ОМ при коэффициенте корреляции (R) соответственно 0,85 и 0,80 и целесообразность применения на практике стабилизатора ВГНКИ-3. Это обусловлено тем, что исходное сырье для производства ОМ нестандартно по качеству, поэтому с практической точки зрения более целесообразно и более практично использовать защитную среду ВГНКИ-3. Полученные данные свидетельствуют о том, что лиофилизированный штамм ВН-96 вируса ТГЭС со стабилизатором ВГНКИ-3 является достаточно стабильным препаратом (табл. 5).