2 Итог по разделу «Физиология микробов. Санитарная микробиология. Санитарно-микробиологический контроль в фармацевтических учреждениях. Химиотерапевтические препараты. Антибиотики. Бактериофагия. Медицинская биотехнология. Генетика микроорганизмов»

1.Основные компоненты химического состава бактериальной клетки, их функции.

Вода – 75-85% (составляет основную массу микробной клетки, биохимические функции воды аналогичны таковым у эукариотов: часть воды находится в связанном состоянии с белками, углеводами и другими веществами, входя в состав клеточных структур; остальная вода находится в свободном состоянии – служит дисперсной средой для коллоидов и растворителем различных органических и минеральных соединений, с водой все вещества поступают в клетку и выводятся из нее).

Сухое вещество – 15-25%, состоит из органических веществ и минеральных элементов:  органические вещества:

 белки – 50-80% (основные компоненты клетки, в бактериальной клетке насчитывается более 2 тыс. различных белков, представлены в виде простых (протеины) и сложных (протеиды) соединений, функции их аналогичны белкам эукариот – входят в состав различных структур клетки, являются строительным материалом и выполняют ферментативные функции);

 нуклеиновые кислоты – 10-30% (представлены в виде РНК и ДНК – ДНК обеспечивает наследственность и изменчивость бактерий, а РНК ответственны за биосинтез клеточных белков);  углеводы – 12-28% (содержатся в виде моно-, ди- и полисахаридов, а также связаны с белками и липидами, входят в состав клеточных структур, используются для синтеза различных веществ и в качестве энергетического материала, часто откладываются в виде запасных питательных веществ);  липиды – 3-10%, у некоторых бактерий, например, микобактерий – возбудителей туберкулеза и лепры, содержание липидов достигает до 30-40% (представлены в трех фракциях – фосфолипиды, воски и жирные кислоты, являются необходимыми компонентами клеточной стенки и ЦПМ, также используются для синтеза различных веществ).

 минеральные вещества – 5-15%, по количественному содержанию у бактерий можно разделить на 4 группы:

 макробиогенные элементы (2-60%): азот, водород, кислород, углерод – составляют основу органических веществ, поэтому называются органогенными;

 олигобиогенные элементы (0,02-0,1%): калий, натрий, хлор, сера, магний, железо, кальций, фосфор;

 микробиогенные элементы (0,01%): цинк, марганец, кобальт, медь, фтор, бром, йод;  ультрамикробиогенные элементы

малые молекулы:  молекулы-предшественники, поступающие в клетку извне: H2O, CO2, N2, ионы Mg2+ , Ca2+ , K + , Cl- , NO3 - , SO4 2- , PO4 2- и другие;  промежуточные молекулы органических кислот;  молекулы строительных блоков: аминокислоты, мононуклеотиды, простые сахара, глицерин, жирные кислоты.  большие молекулы (макромолекулы):  белки;  нуклеиновые кислоты;  полисахариды;  липиды. У прокариотов имеются новые соединения, не встречающиеся в клетках эукариот: пептидогликан, корд-фактор, дипиколиновая кислота, тейхоевые и липотейхоевые кислоты и т.д.

2. Питание бактерий. Особенности питания бактерий

По источнику углерода бактерии делят на:

- автотрофы – источником является СО2;

- гетеротрофы – источниками являются различные органические соединения (глюкоза, спирты, аминокислоты, органические кислоты); По источнику энергии: - фототрофы – используют энергию солнечного света;

- хемотрофы – используют энергию химических реакций окисления неорганических и органических соединений. По донору Н2 (е):

- литотрофы – донором являются неорганические соединения (Н2О, H2S);

- органотрофы – донором являются органические соединения (карбоновые кислоты, аминокислоты, глюкоза и т.д.). По источнику азота:

- аминоавтотрофы – источником является атмосферный азот, аммонийные соли, нитраты, нитриты;

- аминогетеротрофы – источником являются белки (органические вещества).

Фотоавтотрофы – это фотосинтезирующие бактерии, использующие энергию солнечного света для синтеза органических соединений из неорганических соединений.

Хемоавтоторофы синтезируют органические вещества из СО2 за счет энергии реакций окисления неорганических соединений. К ним относятся нитрифицирующие бактерии (NH3  HNO3), серобактерии (H2S  S; H2SO4), железобактерии (Fe2+  Fe3+). Хемо(органо)гетеротрофы для синтеза собственных органических соединений используют энергию окисления других органических веществ, которые являются одновременно и источниками углерода. К ним относится большинство бактерий: а) сапрофиты, использующие органические вещества отмерших организмов (бактерии брожения и бактерии гниения); б) симбионты, использующие органические вещества других живых организмов, не нанося им вреда (образуют симбиоз); в) паразиты, использующие органические вещества живых организмов, нанося им вред. Паразиты бывают облигатные (способны жить и расти только внутри живой клетки) и факультативные (после гибели хозяина питаются сапрофитно). Микроорганизмы, способные синтезировать все соединения из глюкозы и солей аммония называются прототрофами. Микроорганизмы, которые не способны синтезировать все соединения, называются ауксотрофами (многие патогенные бактерии).

3. Механизмы питания бактерий.

Механизмы транспорта через мембрану:

а) простая диффузия – вещества транспортируются без затраты энергии по направлению меньшей концентрации;

б) облегченная диффузия – происходит при большей концентрации веществ вне клетки при участии транспортных белков - пермеаз;

в) активный транспорт – осуществляется против разницы концентрации с затратой энергии при помощи транспортных белков;

г) транслокация химических групп – в процессе переноса через мембрану молекула вещества химически изменяется.

4. Типы питания микробов.

5. Общие требования к искусственным питательным средам.

а) среды должны быть питательными - содержать все необходимые для жизнедеятельности вещества;

б) иметь определенное значение рН; для большинства патогенных микробов оптимальным является рН 7,2-7,4;

в) обладать буферностью – содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена микроорганизмов, для того чтобы не изменялось значение рН среды;

г) быть изотоничными - осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки;

д) быть стерильными для получения чистой культуры;

е) содержать достаточное количество Н2О, т.к. бактерии питаются по законам осмоса и диффузии;

ж) обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, для аэробов rH2 – не ниже 10; для анаэробов – не выше 5;

з) быть прозрачными;

6. Классификация питательных сред по происхождению, по консистенции, по составу и назначению.

По консистенции среды делят на:

а) жидкие: пептонная вода (ПВ), мясопептонный бульон (МПБ);

б) полужидкие: полужидкий мясопептонный агар (МПА) и др.;

в) плотные или твердые: МПА, мясопептонный желатин, свернутая сыворотка;

г) сыпучие: разваренное пшено, кварцевый песок;

д) сухие – гигроскопические порошки, выпускаемые промышленностью;

Для уплотнения сред используют агар, желатин или селикагель. Агар – полисахарид, выделенный из морских водорослей. Он образует в воде гели, которые плавятся при температуре 100 С и застывают при 45 С. К полужидким средам агар добавляют в количестве 0,5% (0,3-0,7%), к плотным – 1,5-2%.

По составу среды делят на: а) естественные – натуральные продукты (яйца, овощи), животные ткани, желчь, сыворотка крови; б) искусственные – среды, приготовленные из различных настоев или отваров с добавлением неорганических солей, углеводов, азотистых веществ;

в) синтетические – среды, приготовленные из определенных химических соединений в точно указанных концентрациях.

По назначению среды делят на:

а) основные (простые) – используют для культивирования многих видов микроорганизмов: ПВ, МПБ, МПА; на простых средах хорошо растут прототрофные бактерии; простые среды служат основой для приготовления ряда сложных питательных сред;

б) специальные (сложные) - используют для тех микроорганизмов, которые не растут на простых средах: сахарный МПБ, сахарный МПА, сывороточный МПБ и МПА, кровяной МПА, асцитический МПБ;

в) элективные (избирательные) – используют для определенных видов; создаются оптимальные условия для этих видов, а другие виды не растут или растут плохо: щелочная ПВ (для холерного вибриона), среда Сабуро (для грибов), желточно-солевой агар (для стафилококка), сывороточные среды – среда Ру и среда Леффлера (для дифтерийных коринебактерий), среда Китта-Тароцци (для анаэробов), среды с желчью (для тифо-паратифозных бактерий), среды с глицерином (для микобактерий туберкулеза);

г) дифференциально-диагностические среды используют для изучения биохимических свойств и дифференцировки (отличия) одного вида микроорганизмов от другого по его ферментативным свойствам: среды Эндо, Левина, Плоскирева, среды Гисса. Состав сред подбирается так, чтобы выявить характерные отличия ферментативных свойств одного вида от другого.

Среда Эндо состоит из МПА, 1 % лактозы, фуксина и сульфита натрия, который его обесцвечивает, исходная среда имеет светло-розовый цвет.

Среда Левина состоит из МПА, лактозы, эозина, метиленовой сини и фосфорнокислого натрия, исходная среда имеет красно-фиолетовый цвет.

Среда Плоскирева состоит из МПА, лактозы, бриллиантового зеленого, йода, нейтрального красного, солей желчных кислот, минеральных солей. Эта среда также является элективной, т.к. подавляет рост многих микробов (кишечной палочки и др.) и способствует лучшему росту некоторых болезнетворных бактерий (возбудителей брюшного тифа, паратифов).

7. Простые питательные среды, их приготовление и стерилизация.

основные (простые) – используют для культивирования многих видов микроорганизмов: ПВ, МПБ, МПА; на простых средах хорошо растут прототрофные бактерии; простые среды служат основой для приготовления ряда сложных питательных сред;

Мясопептонный бульон (МПБ) В состав МПБ входят мясная вода, пептон и поваренная соль. Для приготовления мясной воды используют свежее мясо крупного рогатого скота или лошадей. Мясо освобождают от костей, жира и сухожилий и пропускают через мясорубку. Полученный фарш заливают водой из расчета 1:2 (например, 1 кг фарша заливают 2 л воды). Ставят на 18—20 ч в прохладное место (4—6° С), затем кипятят в течение часа и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Фарш отжимают, к фильтрату добавляют воды до первоначального объема, разливают его по колбам или бутылям и стерилизуют в автоклаве при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 30 мин. Или заливают двукратным количеством воды, кипятят в тече­ние часа, дают остыть, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Фарш отжимают, к фильтрату добавляют воды до первоначального объема и стерилизуют его в течение 30 мин при избыточном давлении 0,1 МПа.

При варке мясной воды на поверхности жидкости появляется некоторое количество жира, который необхо­димо снять.

Для приготовления МПБ к мясной воде добавляют 1% пептона и 0,5% химически чистой поваренной соли, кипятят 10 мин, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,2—7,4 прибавлением щелочи или двууглекислой соды и снова кипятят 10 мин. Профильтрованный бульон должен быть цвета соломы и совершенно прозрачным. Бульон разливают по пробиркам и колбам, закрывают ватными пробками, пробки обвязывают пергаментной бумагой и стерилизуют 20—30 мин при избыточном давлении 0,1 МПа.

Мясопептонный агар (МПА). К мясопептонному бульону добавляют 2—3% нарезанного агар-агар; нагревают в автоклаве или в текучепаровом аппарате до полного расплавления агар-агара. Устанавливают рН 7,2—7,4. Дают остыть до 50° С, осветляют путем добавления белка одного куриного яйца, разведенного двойным количеством дистиллированной воды . Ставят на 20 мин в автоклав при избыточном давлении 0,1 МПа для свертывания белка и тем самым осветляют среду, фильтруют через слой марли и ваты (рис. 1). Можно пользоваться другой методикой. К мясопептонному бульону добавляют 2—3% нарезанного агар-агара, нагревают до полного расплавления его. После остывания застывший плотный агар вынимают из посу­ды и отрезают нижнюю часть, содержащую осадок. За­тем вновь расплавляют, разливают по пробиркам и стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 20 мин. Необходимо, чтобы прозрачность агара позволяла свободно читать напечатанный на бумаге шрифт при наложении на него бактериологической чашки с агаром, налитым слоем толщиной 20 мм. После стерилизации для того, чтобы агар в пробирках застыл столбиком, их оставляют в вертикальном положении. Если нужно при­готовить агар скошенной формы, пробирки с расплавлен­ным агаром располагают в наклонном положении так, чтобы среда заняла две трети пробирки, и в таком виде оставляют до застывания среды . При этом про­бирки необходимо предохранять от действия солнечного света.

8. Специальные питательные среды, их примеры. Элективные питательные среды, их примеры.

специальные (сложные) - используют для тех микроорганизмов, которые не растут на простых средах: сахарный МПБ, сахарный МПА, сывороточный МПБ и МПА, кровяной МПА, асцитический МПБ;

элективные (избирательные) – используют для определенных видов; создаются оптимальные условия для этих видов, а другие виды не растут или растут плохо: щелочная ПВ (для холерного вибриона), среда Сабуро (для грибов), желточно-солевой агар (для стафилококка), сывороточные среды – среда Ру и среда Леффлера (для дифтерийных коринебактерий), среда Китта-Тароцци (для анаэробов), среды с желчью (для тифо-паратифозных бактерий), среды с глицерином (для микобактерий туберкулеза);

9. Дифференциально-диагностические среды, их примеры.

дифференциально-диагностические среды используют для изучения биохимических свойств и дифференцировки (отличия) одного вида микроорганизмов от другого по его ферментативным свойствам: среды Эндо, Левина, Плоскирева, среды Гисса. Состав сред подбирается так, чтобы выявить характерные отличия ферментативных свойств одного вида от другого.

Среда Эндо состоит из МПА, 1 % лактозы, фуксина и сульфита натрия, который его обесцвечивает, исходная среда имеет светло-розовый цвет.

Среда Левина состоит из МПА, лактозы, эозина, метиленовой сини и фосфорнокислого натрия, исходная среда имеет красно-фиолетовый цвет.

Среда Плоскирева состоит из МПА, лактозы, бриллиантового зеленого, йода, нейтрального красного, солей желчных кислот, минеральных солей. Эта среда также является элективной, т.к. подавляет рост многих микробов (кишечной палочки и др.) и способствует лучшему росту некоторых болезнетворных бактерий (возбудителей брюшного тифа, паратифов).

Среды Гисса служат для изучения сахаролитических свойствах микробов.

Среды Гисса содержат лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу и маннит и различные индикаторы. Если бактерии расщепляют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды, а если до кислоты и газа – наблюдают появление газообразных продуктов.

Жидкие среды Гисса состоят из пептонной воды, 1 % углевода и индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). В среду опускается поплавок, который при стерилизации заполняется средой. Исходный цвет среды – соломенножелтый. При расщеплении углевода цвет среды становится ярко-розовым (красным). Если образуется газ, он накапливается в поплавке. Если углевод не расщепляется, цвет среды не изменяется.

Полужидкие среды Гисса состоят из 0,2-0,5 % мясо-пептонного агара (МПА), 1 % углевода и индикатора ВР (водно-голубая краска и розоловая кислота). Исходный цвет среды - розовато-серый. При расщеплении углевода цвет среды становится голубым, а если образуется газ, наблюдаются разрывы в среде. Определенный вид бактерий ферментирует не все, а только некоторые углеводы, поэтому в одних пробирках цвет изменяется, а в других – не изменяется, и получается "пестрый ряд". Каждый вид бактерий характеризуется своим "пестрым рядом".

10. Типы биологического окисления микробов. Аэробный тип биологического окисления, признаки, присущие ему.

Дыхание (биологическое окисление) – окислительно-восстановительные реакции, идущие с выделением энергии и образованием АТФ. Субстраты дыхания: глюкоза, аминокислоты, спирты и др.

Аэробное дыхание – участвует кислород. Окислительное фосфорилирование (дыхание) – это процесс образования АТФ при переносе электронов от донора к акцептору через дыхательную цепь. Донором электронов могут служить органические (углеводы, жирные кислоты, аминокислоты) и неорганические вещества: H2S, Fe3+ («сероводородное дыхание», «железное дыхание»). Акцептором электронов – только неорганические вещества, которые восстанавливаются. В зависимости от конечного акцептора электронов различают аэробное и анаэробное дыхание. При аэробном дыхании конечным акцептором электронов служит молекулярный кислород, который преобразуется в высокотоксичные для клетки соединения: перекись водорода и супероксидный радикал. Аэробные и аэротолерантные (устойчивые к кислороду) прокариоты обладают специальными ферментами, супероксид-дисмутазой и каталазой, катализирующими превращение токсических форм кислорода в воду.

Брожение – неполное окисление в анаэробных условиях. Продуктами брожения могут быть этиловый спирт, молочная, масляная, уксусная, пропионовая кислоты. Различают спиртовое, молочнокислое, уксуснокислое, маслянокислое, пропионовокислое и другие виды брожения.

11. Анаэробный тип биологического окисления, признаки, присущие ему. Учёный, открывший анаэробный тип биологического окисления. Генрих отто виланд

Анаэробное дыхание – без участия кислорода. При аэробном расщеплении выделяется значительно больше энергии, т.е. оно энергетически более выгодно, чем анаэробное расщепление.

В клетках облигатных анаэробов эти ферменты отсутствуют, поэтому кислород губительно действует на данные бактерии. При анаэробном дыхании конечным акцептором электронов служат неорганические вещества, содержащие «связанный кислород» (нитраты, нитриты, сульфаты, карбонаты): нитраты восстанавливаются до молекулярного азота или аммиака («нитратное дыхание»), а сульфаты восстанавливаются до сероводорода («сульфатное дыхание»). Процесс переноса электронов от донора к акцептору при дыхании включает следующие этапы:

1. Окисление субстрата с переносом электронов на внутренний акцептор клетки (НАД, ФАД, НАДФ) через ЦТК (в результате одного оборота цикла происходит 2 декарбоксилирования, 4 дегидрирования и 1 субстратное фосфорилирование);

2. Перенос электронов по дыхательной цепи с образованием АТФ;

3. Перенос электронов на внешний акцептор и возвращение дыхательной цепи в исходное состояние.

12. Брожение. Учёный, открывший микробную природу брожения. Виды брожения.

Субстратное фосфорилирование (брожение) – это способ получения энергии, при котором происходит сопряженное окисление-востановление субстрата без участия кислорода (в строго анаэробных условиях). Это наиболее примитивный способ получения энергии, т.к. из субстрата извлекается лишь незначительная часть содержащейся в нем энергии. Брожение было известно человеку давно, однако биологическая сущность доказана в работах Л. Пастера, который установил, что изменения в органическом субстрате – результат жизнедеятельности микроорганизмов.

Процесс брожения протекает в две фазы:

1. Начальная (окисление) – расщепление углеводов до пировиноградной кислоты (пирувата) тремя путями:

 гликолитический (гликолиз, путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса, фруктозо-1,6- дисфосфатный путь) – 2 АТФ и 2 НАДН2;

 пентозофосфатный (путь Варбурга-Диккенса-Хорекера-Рэкера, фосфоглюконатный путь) – 2 АТФ, 2 НАДФН, пентозофосфат и СО2;

 2-кето-3дезокси-6-фосфоглюконатный (путь Энтнера-Дудорова, отличается тем, что глюкоза без фосфорилирования окисляется в глюконовую кислоту, последняя превращается в 2-кетоЗ-фосфоглюконовую кислоту, которая расщепляется на два C3-фрагмента: ПВК и глицериновый альдегид) – наблюдается только у бактерий рода Pseudomonas, Alcaligenes, у высших организмов отсутствует – 1 АТФ, 1 НАДФ и 1 НАДН2;

2. Конечная (восстановление) – происходит присоединение атомов водорода для восстановления пировиноградной кислоты, при этом образуются разные продукты, в зависимости от которых выделяют разные типы брожения.