40. Лекарственная устойчивость микробов

Лекарственная устойчивость микроорганизмов — способность микроорганизмов сохранять жизнедеятельность в присутствии относительно высоких концентраций антибиотиков или химиотерапевтических средств иной природы. Лекарственная устойчивость у бактерий обнаруживается чаще, чем у грибков и простейших. У вирусов чувствительность к известным антибиотикам или к химиотерапевтическим средствам практически отсутствует.

Естественная лекарственная устойчивость является видовым признаком и не зависит от первичного контакта с данным антибиотиком (в ее основе нет никаких специфических механизмов). Недоступность мишени для данного антибиотика обусловлена слабой проницаемостью клеточной стенки и цитоплазматической мембраны. Низкая проницаемость к нескольким антибиотикам обусловливает полирезистентность этих бактерий.

Приобретенная лекарственная устойчивость возникает только в результате изменения ее генома (хромосомный и плазмидный). Варианты генетических изменений: Мутация в генах бактериальной хромосомы Приобретение дополнительных генов, носителями которых являются - хромосомы других бактерий, - R-плазмиды, - транспозоны, - бактериофаги

• Первичная лекарственная устойчивость – резистентность к противотуберкулезным препаратам у впервые выявленных больных до начала химиотерапии. • Приобретенная (вторичная) - развивается в процессе лечения противотуберкулезными препаратами Причины: низкий уровень ПТП в организме, обусловленный НЕРЕГУЛЯРНЫМ приемом препаратов Применение монотерапии Отсутствие необходимых для лечения препаратов

41. Бактериофагия.

Вирусы не имеют клеточного строения. Это неклеточные формы жизни. Они относятся к царству Vira. Размеры выражаются в нанометрах (нм); 1 нм = 10-3 мкм. Они не видны в световой микроскоп и проходят через бактериальные фильтры. Вирусы были открыты в 1892 г. Д.И. Ивановским. В настоящее время известно больше, чем 600 возбудителей вирусных инфекций у человека: оспы, бешенства, гриппа, паротита, кори, полиомиелита, клещевого энцефалита, геморрагической лихорадки, СПИДа и др. Вирусы – это облигатные внутриклеточные паразиты. Они проникают в живую клетку и размножаются внутри клетки. Поэтому на искусственных питательных средах вирусы расти не могут.

Выделяют две формы вирусов: а) внеклеточная форма – вирион; сформированная вирусная частица; б) внутриклеточная форма или вегетативная форма – размножающийся вирус.

Морфологию и структуру вирионов изучают при помощи электронного микроскопа.

Вирионы имеют размеры от 15-18 нм-300-400 нм и различную форму: палочковидная, пулевидная, сферическая и др.

Вирионы состоят из ДНК или РНК и белков. Это комплексы нуклеиновых кислот и белков - нуклеопротеиды. ДНК или РНК находятся в центре, а снаружи – одна или две оболочки.

Функции ДНК или РНК - хранение и передача наследственной информации.

Функции белков:

а) защитная функция (белки капсида);

б) стабилизация структуры нуклеиновой кислоты (внутренние белки);

в) ферментативная функция; ферменты вирусной частицы участвуют в проникновении в клетку (лизоцим, АТФаза и т.д.), в репликации и транскрипции (ДНК- и РНК-полимеразы).

Если вирусы имеют одну оболочку, они называются простыми. Эта оболочка состоит из белковых субъединиц – капсомеров и называется капсид. Нуклеиновая кислота и капсид вместе называются нуклеокапсидом. Если вирусы имеют две оболочки они называются сложными. Вторая оболочка называется суперкапсид. Суперкапсид образуется при выходе вируса из клетки-хозяина, поэтому в его составе имеются углеводы и липиды мембраны этой клетки.

Липиды и углеводы сложных вирусов образуют комплексы с белками – липопротеиды и гликопротеиды. Они защищают вирусы от неблагоприятных условий. Гликопротеиды – вирусные антигены – гемагглютинины, которые вызывают реакцию агглютинации эритроцитов. В основу классификации вирусов положены следующие принципы: тип нуклеиновой кислоты, ее структура, количество нитей, размер и морфология вирионов, количество капсомеров и тип симметрии, наличие суперкапсида, чувствительность к эфиру и дезоксихолату, место размножения в клетке, антигенные свойства и др.

3. Опишите фазы взаимодействия вирулентного бактериофага с чувствительной к нему бактериальной клеткой.

Нуклеиновые кислоты и белки синтезируются клеткой-хозяином раздельно в разных частях клетки. После этого они объединяются друг с другом. Такой способ называется разобщенная или дизъюнктивная репродукция. Репродукция вирусов внутри клетки протекает в несколько стадий. 1. Адсорбция – прикрепление вирусов к поверхности клетки на рецепторах. Для этого у вирусов также имеются специальные поверхностные структуры (шипы). Они специфически прикрепляются к рецепторам клетки.

2. Проникновение в клетку – вирусы проникают в клетку двумя способами: а) пиноцитоз; б) слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной.

3. Дезинтеграция ("раздевание") – удаление оболочек и освобождение ДНК или РНК. Вирусная частица распадается на нуклеиновую кислоту и белки. В результате вирус нельзя обнаружить в клетке никакими чувствительными методами, он как бы исчезает, растворяется. Это явление называется эклипс – "затмение".

4. Синтез ДНК или РНК и вирусных белков. Для репликации, транскрипции и трансляции используются: а) ферменты клетки-хозяина; б) вирионные ферменты; в) вирусиндуцированные ферменты (информация об их структуре содержится в геноме вируса, а синтез протекает внутри клетки).

5. Сборка (морфогенез) вириона – нуклеиновые кислоты и белки соединяются друг с другом.

6. Выход из клетки – вирусные частицы выходят из клетки двумя способами: а) одновременно через отверстия в мембране клетки; б) почкование; при этом образуется суперкапсид у сложных вирусов.

4. Как обнаружить действие бактериофага на бактерии в жидкой и на плотной питательной среде? Как будет выглядеть положительный результат?

Метод титрования бактериофага по Аппельману (на жидкой питательной среде).

Готовят десятикратные разведения исследуемого бактериофага в питательном бульоне. Для этого в ряд пробирок разливают по 4,5 мл бульона. В 1-ю пробирку добавляют 0,5 мл исследуемого фага. Тщательно перемешивают и переносят в последующие пробирки (из пробирки в пробирку) по 0,5 мл соответствующего разведения фага с уменьшением его концентрации в десять раз. Получают разведения от 10-1 до 10-9 степени. Затем в пробирки вносят по 1 капле суточной культуры соответствующих бактерий. После инкубации в течение суток определяют титр фага. За титр бактериофага принимают то его максимальное разведение, при котором наблюдается полный лизис культуры (просветление среды).

Метод титрования бактериофага по Грациа (на плотной питательной среде) .

Питательный агар разливают в чашки Петри и подсушивают в термостате. Готовят полужидкий питательный агар по 3-4 мл в пробирке и растапливают его на водяной бане. Делают десятикратные разведения исследуемого бактериофага в изотоническом растворе хлорида натрия. Затем 0,5 мл каждого разведения бактериофага смешивают с таким же объёмом суточной бульонной культуры чувствительных к бактериофагу бактерий и выливают эту смесь в пробирку с полужидким агаром температурой 45°C. Приготовленную смесь быстро выливают на поверхность первого слоя агара в чашке Петри, где она застывает в виде тонкого слоя. После застывания второго слоя агара чашки инкубируют при 37°C в течение суток. Смеси бактериофага, культуры и полужидкого агара делают из разведений фага 102 -1010 в зависимости от предполагаемого титра фага. Не заражённые бактериофагом бактерии, размножаясь, образуют сплошной газон роста на поверхности питательного агара. Каждая инфицированная бактериофагом бактерия лизируется и освобождает потомство бактериофага, которое внедряется в интактные клетки бактерий, и весь цикл повторяется. В результате лизиса клеток на сплошном бактериальном газоне появляются «стерильные» пятна или негативные колонии бактериофага. Число этих пятен соответствует количеству фаговых частиц в засеянной смеси. 56 Количество пятнообразующих единиц в 1 мл исходной суспензии бактериофага называется его титром.

5. Что такое титр бактериофага? Как его определяют и обозначают?

Титр бактериофага - это количество активных фаговых частиц в единице объема исследуемого материала. Для определения титра бактериофага наиболее широко в практике работы с бактериофагами применяется метод агаровых слоев, предложенный А. Грациа (A. Gratia) в 1936 г. Этот метод отличается простотой выполнения и точностью получаемых результатов и с успехом используется также и для выделения бактериофагов. Сущность метода состоит в том, что суспензию бактериофага смешивают с культурой чувствительных бактерий, вносят в агар низкой концентрации («мягкий агар») и наслаивают на поверхность ранее подготовленного 1,5% питательного агара в чашке Петри.

6. Что такое умеренный бактериофаг. Опишите взаимодействие умеренного бактериофага с бактериальной клеткой.

Умеренные бактериофаги – группа вирусов бактерий, выделенная по характеру взаимодействия фага с микробной клеткой. Умеренные фаги в жизненном цикле могут развиваться по двум вариантам: вовлекаться в литический цикл или превращаться в профаг, с дальнейшим развитием по лизогенному пути.

Применяемые на практике препараты бактериофагов представляют собой фильтрат бульонной культуры соответствующих микробов, лизированных фагом, содержащий живые частицы фага, а также антигены бактерий, освободившиеся из бактериальных клеток при их лизисе. Полученный препарат – жидкий бактериофаг – должен иметь вид совершенно прозрачной жидкости жёлтого цвета большей или меньшей интенсивности. Препарат проходит контроль на стерильность (методом посева), безвредность и литическую активность (титр). Диагностические бактериофаги выпускаются как в жидкой, так и в сухой форме, в ампулах. Перед началом работы сухой бактериофаг разводится. Для лечебно-профилактических целей бактериофаги выпускаются в форме таблеток с кислотоустойчивой оболочкой, в жидком виде или в суппозиториях. Таблетированный сухой бактериофаг более стабилен при хранении и удобен при применении. Одна таблетка сухого бактериофага соответствует 20-25 мл жидкого препарата. Срок годности сухого и жидкого препарата составляет 1 год. Жидкий бактериофаг следует хранить при температуре +2 – +10 0С, сухой – не выше +10С, но его можно хранить в холодильнике и при отрицательной температуре. Принятый внутрь бактериофаг сохраняется в организме в течение 5-7 дней. Как правило, приём бактериофага не сопровождается какими-либо реакциями или осложнениями. Противопоказаний к приёму нет. 57 Бактериофаги могут применять также в виде орошений, полосканий, примочек, тампонов. Инъекционные формы бактериофагов можно вводить в стерильные полости – брюшную, плевральную, суставную и в мочевой пузырь. Существует форма выпуска бактериофагов в свечах для ректального применения.

Наиболее широко применяется стафилококковый, стрептококковый, холерный бактериофаги, эффективные в терапии как острых, так и хронических форм заболевания, а также бактерионосительства. Кроме того, существуют фаги для лечения брюшного тифа, дизентерии, сальмонеллезов.

Метод фаготипирования имеет большое значение при эпидемиологических исследованиях, так как позволяет выявить источник и пути распространения возбудителей заболеваний. Определение фаговара выделенной чистой культуры проводят с помощью набора типовых диагностических бактериофагов. Фаговар культуры определяют по тому типовому фагу, который вызвал её лизис. Для проведения фаготипирования исследуемую суточную культуру бактерий засевают «газоном» на поверхность питательного агара в чашки Петри, подсушивают в термостате, делят со стороны дна чашки на квадраты и наносят пипеткой по одной капле соответствующего бактериофага в тестразведении, указанном на ампуле. В один квадрат бактериофаг не вносят, для контроля роста культуры. Чашку термостатируют при 37оС 18-20 часов, после чего оценивают результат реакции. Положительный результат реакции фаголизиса – лизис культуры в месте нанесения бактериофага («негативные» колонии) при наличии роста в контроле свидетельствует о соответствии культуры бактериофагу и принадлежности с учётом её фаголизабельности к соответствующему виду.

42. Генетика микроорганизмов. Особенности структуры генома прокариотов.

-Относительно высокое (70%) содержание структурных генов на имеющуюся ДНК . -Высокое абсолютное число генов. -Организация генов в опероны – целостно транскрибируемые группы функционально родственных генов. - Отсутствует интрон- экзоннная структура – гены непрерывны. - Присутствие внехромосомной ДНК – плазмид -Репликация, транскрипция и трансляция происходят в цитоплазме - Процесс транскрипции и трансляции проходит одновременно - Полицистронные мРНК

43. Внехромосомные факторы наследственности.

Внехромосомные молекулы ДНК представлены плазмидами, мигрирующими генетическими элементами- транспозонами и инсервационными (вставочными) или IS- последовательностями.

Плазмиды- экстрахромосомный генетический материал (ДНК), более просто устроенные по сравнению с вирусами организмы, наделяющие бактерии дополнительными полезными свойствами. По молекулярной массе плазмиды значительно меньше хромосомной ДНК, содержат от 40 до 50 генов.

Плазмиды - это молекулы ДНК, которые или находятся вне хромосомы, в автономном состоянии, в виде колец, прикрепленных к мезосомам, или встроены в хромосому (интегрированное состояние). Плазмида может быть удалена из бактерии, что не влияет на ее жизнеспособность.

Плазмиды могут распространяться по вертикали (при клеточном делении) и по горизонтали, прежде всего путем конъюгационного переноса. В зависимости от наличия или отсутствия механизма самопереноса (его контролируют гены traоперона) выделяют конъюгативные и неконъюгативные плазмиды. Плазмиды могут встраиваться в хромосому бактерийинтегративные плазмиды или находиться в виде отдельной структуры- автономные плазмиды (эписомы).

44. Формы изменчивости микроорганизмов.

Модификационная = ненаследуемая, фенотипическая, адаптационная: – возникает как приспособительная реакция организма на условия среды, – характеризуется появлением временных, не закрепленных в генотипе свойств, и их быстрой утратой,

Наследуемая = генотипическая – изменения затрагивают лишь отдельные клетки, – приобретенные признаки передаются потомству и в силу лучшей адаптации к условиям существования измененные клетки с новыми признаками постепенно вытесняют клетки исходного штамма. Изменения генома могут происходить в результате мутаций и рекомбинаци

45. Применение генетических методов в диагностике инфекционных заболеваний.

Для диагностики инфекционных заболеваний генетическими методами маркером возбудителя является его геном. Методы индикации нуклеиновых кислот применяют для диагностики вирусных инфекций, для идентификации бактерий (особенно таких, которые трудно выделить) и для определения точного таксономического положения микроорганизмов. Методы позволяют обнаружить микроорганизм в исследуемом материале (воде, продуктах, материале от больного) по наличию ДНК без его выделения в чистую культуру.

Метод молекулярной гибридизации основан на способности ДНК и РНК специфически соединяться (гибридизироваться) с комплементарными олигонуклеотидными фрагментами, искусственно синтезированными и меченными ферментом, флюорохромом или изотопом. Эти фрагменты называются зондами

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на многократном увеличении числа копий (амплификации) определенного участка ДНК, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой (рис. 33). ПЦР – это очень чувствительный метод, теоретически для получения результата достаточно наличие в материале одной молекулы ДНК.

46. Достижения генетической инженерии и биотехнологии.

Генетическая инжене́рия (генная инженерия) — совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами, введения их в другие организмы и выращивания искусственных организмов после удаления выбранных генов из ДНК.

Методы генной инженерии основаны на получении фрагментов исходной ДНК и их модификации.

Для получения исходных фрагментов ДНК разных организмов используется несколько способов:

– Получение фрагментов ДНК из природного материала путем разрезания исходной ДНК с помощью специфических нуклеаз (рестриктаз).

– Прямой химический синтез ДНК, например, для создания зондов