Среды Гисса служат для изучения сахаролитических свойствах микробов

13. Классификация микробов по типу биологического окисления. Примеры.

. Облигатные (строгие) аэробыспособны получать энергию только путем дыхания и поэтому обязательно нуждаются в молекулярном кислороде. Энергию получают окислительным метабо­лизмом, используя кислород как терминаль­ный акцептор электронов в реакции, катали­зируемойцитохромоксидазой. Пример: представители родовPseudomonas иBacillus.

2. Облигатные (строгие) анаэробыне способны расти и размножаться в присутствии кислорода, поскольку у них отсутствуют ферменты, расщепляющие токсические соединения кислорода.Для них как тип окисли­тельно-восстановительных процессов характерна ферментация, при которой происходит перенос электронов от субстрата-донора к субстрату-акцептору. Тип метаболизма у них — бродильный. Пример: микроорганизмы родовClostridiumи Bacteroides.

3. Факультативные анаэробы способны расти и размножаться как в при­сутствии кислорода, так и в его отсутствии.Они обладают смешанным типом метабо­лизма и могут ис­пользовать в качестве терминальных акцепторов электронов как молекулярный кислород, так и органические соединения. Процесс получения энергии у них мо­жет происходить кислородным дыханием в присутствии кислорода, а в его отсутствиипереключаться на брожение. Пример: Escherichia coli и Saccharomyces.

4. Микроаэрофилынуждаются в низком содержании свободного кислорода 2-10%. Естественной средой обитания микроаэрофилов является мукозный слой, покрывающий эпителий желудка, где концентрация кислорода невелика. У микроаэрофилов имеются ферменты, которые инактивируются при контакте с сильными окислителями иактивны только при низких значениях парци­ального давления кислорода, например фер­мент гидрогеназа. Многие микроаэрофильные бактерии растут быстреев избыточном количестве углекислого газа (до 20%), поэтому их называют капнофилами.Пример: Helicobacter pylori, Campylobacter.

5. Аэротолерантные микроорганизмы способны расти в присутствии атмосферного кислорода, но не использовать его в качестве источника энергии. Они осуществляют анаэробный метаболизм (брожение), но устойчивы к действию кислорода при его обычных концентрациях. Пример: Streptococcus pyogenes, Lactobacillus.

14. Окислительно-восстановительный потенциал среды. Характеризует условия протекания в среде окислительных и восстановитель­ных процессов.

В результате взаимодействия двух веществ может происходить окислительно-восстановительная реакция, приводящая к возникновению между ними разности электрических потенциалов – Еh, или редоксипо­тенциала. Величина Еh измеряется обычно милливольтами (мВ). Он тем выше, чем больше отношение концентрации компонентов, способных к окислению, к концентрации компонентов, могущих восстанавливаться. Концентрация окисленной формы водорода (Н⁺) характеризуется величиной рН, концентрация восстановленной формы водорода выражается показателем rH (или rH₂), представляющим собой логарифм величины давления молекулярного водорода, взятый с обратным знаком. Чем меньше величина rH, тем выше восстановительная способность среды. Таким образом, окислительно-восстановительные свойства среды могут характеризоваться как величиной редоксипотенциала Eh, так и условными единицами rH, указывающими концентрацию молекулярного водорода, способную создать данные окислительно-восстановительные условия. Чем выше редоксипотенциал, тем выше окислительная способность среды и тем выше величина r, т.е. ниже концентрация молекулярного водорода, необходимая для создания окислительно-восстановительных условий.

15. Рост и размножение бактерий, скорость и фазы размножения бактерий.

Размножение – увеличение числа особей. Способы размножения бактерий: а) деление клетки на 2 части (бинарное деление); б) почкование; в) распад нитевидных клеток; г) при помощи спор (актиномицеты).

Рост – увеличение массы в результате синтеза клеточного материала. Во время роста бактерии потребляют питательные вещества, и если объем питательной среды не изменяется, то наблюдается ее истощение и прекращение роста. Культивирование (выращивание) бактерий в такой среде называют периодическим, а культуру – периодической. Если при культивировании непрерывно подается свежая питательная среда, то такое культивирование называется непрерывным, а культура – непрерывной.

Рост периодической культуры на жидкой питательной среде разделяют на несколько фаз:

I фаза – лаг-фаза – период между посевом и началом размножения;

II фаза – фаза логарифмического роста – период интенсивного деления бактерий и рост количества клеток;

III фаза – фаза стационарного роста – количество клеток не меняется и равно максимальной концентрации (М-концентрация);

IV фаза – фаза гибели - снижение количества живых клеток; V фаза – фаза уменьшения скорости отмирания клеток – клетки переходят в состояние покоя.

16. Методы культивирования и характер роста аэробов и анаэробов.

Культивирование – искусственное выращивание микроорганизмов. Используется для изучения свойств микроорганизмов и для диагностики инфекционных заболеваний.

Для культивирования необходимо: 1) соответствующая среда; 2) правильно произведенный посев; 3) оптимальные условия: температура, влажность, аэрация (снабжение О2) или создание бескислородных условий для анаэробов; 4) определенной время для выращивания (чаще – 24 час).

Требования к питательным средам. а) среды должны быть питательными - содержать все необходимые для жизнедеятельности вещества; б) иметь определенное значение рН; для большинства патогенных микробов оптимальным является рН 7,2-7,4; в) обладать буферностью – содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена микроорганизмов, для того чтобы не изменялось значение рН среды; г) быть изотоничными - осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки; д) быть стерильными для получения чистой культуры; е) содержать достаточное количество Н2О, т.к. бактерии питаются по законам осмоса и диффузии; ж) обладать определенным окислительно-восстановительным потенциалом, для аэробов rH2 – не ниже 10; для анаэробов – не выше 5; з) быть прозрачными;

Выделение чистой культуры аэробных и анаэробных бактерий. Чистая культура микроорганизмов – это популяция клеток (видимый рост) одного вида, выросшая на стерильной питательной среде. Выделение чистой культуры – бактериологический метод. Этот метод является основным методом диагностики бактериальных инфекций. Для получения чистой культуры необходимо отделить бактериальные клетки разных видов друг от друга. Чаще всего используются механические способы отделения клеток– специальные методы посева: а) посев шпателем по Дригальскому в три чашки Петри; на третьей чашке вырастают отдельные колонии; каждая колония – один вид, т.к. колония – потомство одной клетки; б) посев петлей "штрихами" или "сеткой": делают посев прерывистыми штрихами; в том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост будет в виде сплошного штриха, а на штрихах с небольшим количеством клеток вырастут отдельные колонии; Таким образом, при помощи специальных методов посева получают изолированные колонии разных видов бактерий. Выделение чистой культуры проводят в три этапа:

Первый этап (1-ый день): а) из материала (смесь бактерий разных видов) готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют; б) делают посев материала (смеси бактерий) на чашку Петри с МПА штриховым методом или по методу Дригальского и ставят в термостат при 37С на 24-48 часов. В

торой этап (2-ой день): а) наблюдают посевы и проводят описание колоний разных видов (размер, форма, цвет, поверхность, форма края, структура, консистенция); б) из колоний готовят мазки и окрашивают по Граму (колония должна содержать один вид бактерий); в) делают пересев разных колоний в разные пробирки со скошенным МПА для накопления чистой культуры; выращивают в термостате при 37С 24 часа.

19. Ферменты микробов, их классификация.

Ферменты – это биологические катализаторы (повышают скорость химических реакций). По химической природе они являются белками.

Как и ферменты других организмов, бактериальные ферменты делят на 6 классов в соответствии с типом катализируемых реакций:

- 1 класс – оксидоредуктазы – катализируют окислительно-восстановительные реакции;

- 2 класс – трансферазы – катализируют реакции переноса различных групп от одних соединений к другим;

- 3 класс – гидролазы – катализируют реакции расщепления веществ на более простые соединения с участием воды;

- 4 класс – лиазы – катализируют реакции отщепления (или присоединения) от субстратов различных химических групп негидролитическим путем;

- 5 класс – изомеразы – катализируют реакции изомеризации, т.е. превращения органических веществ в их изомеры;

- 6 класс – лигазы – катализируют реакции синтеза сложных соединений из более простых соединений.

Ферменты бактерий делят на экзо- и эндоферменты.

Эндоферменты катализируют процессы внутри клетки.

Экзоферменты выделяются бактериями в окружающую среду.

Это ферменты: а) пищеварительные ферменты, которые расщепляют сложные питательные вещества до простых веществ; б) защитные ферменты, например, пенициллиназа защищает клеточную стенку от действия антибиотика пенициллина; в) ферменты агрессии – факторы вирулентности патогенных бактерий; - гиалуронидаза – расщепляет гиалуроновую кислоту; - дезоксирибонуклеаза – расщепляет ДНК клеток; - фибринолизин – расщепляет коллаген; - плазмокоагулаза – свертывает плазму крови; - нейраминидаза – расщепляет нейраминовую кислоту; - лецитовителлаза – расщепляет лецитин.

20. Использование бактериальных ферментов в медицине.

Широкое применение в медицинской практике ферменты находят в качестве диагностических (энзимодиагностика)и терапевтических (энзимотерапия)средств. Ферменты также используются в качестве специфических реактивовдля определения ряда метаболитов. Например, фермент глюкозооксидазу применяют для количественного определения глюкозы в моче и крови; фермент уреазу используют для оценки содержания в биологических жидкостях мочевины; с помощью различных дегидрогеназ выявляют наличие соответствующих субстратов, например пирувата, лактата, этилового спирта и т.д.

21. Определение ферментативной активности бактерий для их идентификации.

Для определения сахаролитических ферментов используют среды с сахарами:  среды Гисса (пестрый ряд):

 жидкие – пептонная вода, индикатор Андреде (кислый фуксин), углеводы, спирты;

 полужидкие – пептонная вода, 0,5% агар-агар, индикатор бромкрезол, углеводы, спирты;

 короткие – содержащие моносахара и дисахара (глюкоза, мальтоза, лактоза, сахароза, маннит);  длинные – короткий ряд + моносахара (арабиноза, ксилоза, рамноза, галактоза и др.), полисахариды (инулин, крахмал и др.), спирты (глицерин, дульцит, инозит и др.).

 среда Ресселя – двухсахарный агар (лактоза, глюкоза) и индикатор бромтимоловый синий, Олькеницкого

– трехсахарный агар (лактоза, сахароза, глюкоза), индикатор нейтральный красный и соль Мора для выявления H2S. Под действием сахаролитических ферментов бактерий углеводы и многоатомные спирты расщепляются до кислоты/кислоты и газа. Для обнаружения газа в жидкие среды помещают поплавки, которые при образовании газа всплывают, а в полужидких – заметно появление пузырьков. Для обнаружения кислоты добавляют индикатор, который под ее действием изменяет цвет.

 среды Эндо, Левина, Плоскирева – МПА с лактозой и индикаторами – фуксином, метиленовым синим и нейтральным красным соответственно. У бактерий, ферментирующих лактозу (лактоза+), колонии окрашиваются в цвет индикатора и приобретают металлический блеск, у лактоза– бактерий колонии остаются бесцветными. Для определения протеолитических ферментов используют:  определение конечных продуктов распада белков (индол, H2S, аммиак); Сероводород, индол и аммиак определяют, помещая под пробку пробирки с растущей на МПБ культурой индикаторные бумажки:

 индол (выделяется при разложении триптофана), окрашивает в розовый цвет индикаторную бумажку, пропитанную щавелевой кислотой;

 H2S (продукт распада серосодержащих аминокислот – цистеина, метионина), реагируя с ацетатом свинца на индикаторной бумажке, превращается в сульфат свинца и окрашивает бумажку в черный цвет;