Мазки готовят на предметном стекле. В качестве материала применяют взвесь бактерий, бактериальную культуру, молоко, кровь, мазки отпечатки.
Из жидкой микробной культуры для приготовления мазка в левой руке держат пробирку, в правой бактериологическую петлю. Тщательно прожигают ее в пламени горелки. Пробирку открывают у пламени горелки. Петлей захватывают каплю материала, пробирку закрывают и ставят в штатив. Наносят на предметное стекло каплю и растирают до размера рубля. Препарат выдерживают на воздухе, петлю прожигают. Препарат фиксируют – над пламенем горелки либо смесь Никифорова.
Методы фиксации мазков:
Физический способ. Для фиксации используют мазки, приготовленные из бульонных или агаровых культур. С обратной стороны мазка карандашом по стеклу или маркером обводят его границы. Стекло с мазком, обращенным вверх, медленно проводят 3-4 раза над верхней частью пламени горелки, нагревая стекло не выше 60 °С.
Химический способ используют для фиксации мазков из крови, мазков- отпечатков,и в некоторых случаях, мазков и патологического материала,т.к.высокие температуры разрушают клеточные элементы. Для этих целей мазки погружают в фиксирующие жидкости: метиловый спирт – 5 мин, ацетон – 5 мин, этиловый спирт – 10 мин, смесь Никифорова – 15-20 мин.
Целью фиксации является закрепление микроорганизмов на стекле, обезвреживание микробных клеток, коагуляция белков микробных клеток, после чего они легко воспринимают окраску.
Для приготовления мазков из культуры, выращенной на плотной питательной среде, на обезжиренное предметное стекло бактериологической петлей, предварительно прокаленной до красна (профламбированной) наносят небольшую каплю стерильного физиологического раствора. Затем петлю фламбируют повторно, внося ее в пламя горелки в вертикальном положении, после чего в пробирку (чашку Петри) с культурой вносят бактериологическую петлю, предварительно охладив ее о поверхность стекла. Петлю с культурой осторожно вынимают и вносят в приготовленную заранее на предметном стекле каплю физиологического раствора, тщательно размешивают, равномерно распределяя по стеклу в виде небольшого круга, овала (2 см в диаметре). После окончания приготовления мазка петлю вновь прокаливают.
Простые методы окраски бактерий
При простых методах окраски применяют только один краситель, чаще всего фуксин Пфейффера, метиленовый синий. Раствор красителя наносят на препарат и выдерживают 2-3 мин, затем краску смывают водой, препарат высушивают фильтровальной бумагой и рассматривают под иммерсией. Простая окраска позволяет обнаружить в материале бактерии, быстро определить их морфологию и иметь представление о разнообразии видов.
Сложные методы окраски
Сложные методы окраски основаны на физико-химических различиях состава микробных клеток, их применяют для дифференциации одних бактерий от др.
Сущность этих методов заключается в последовательном воздействии на мазок двух красящих растворов, из которых один является основным, а другой – контрастным. Кроме красящих растворов, применяют различные обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты. В результате разные виды микробов или отдельные структуры внутри микробной клетки окрашиваются в контрастные и разные вещества.
Окрашенные препараты имеют следующие преимущества:
-они неопасны, т.к. все манипуляции проводят с фиксированным и обезвреженным материалом;
-в них легко различимы отдельные детали, структуры микробной клетки, не выявляющиеся в неокрашенном препарате;
-могут храниться длительное время. Недостатки:
-невозможность изучения физиологии микробов (подвижность, характер деления и т.д.);
-деформация микробных клеток после фиксации физическим методом и воздействия красящих растворов.
Окраска по Граму
Предложен в 1884 году датским врачом Г. К. Грамом.
Метод окраски Грама продолжает оставаться стандартной процедурой в медицинской и ветеринарной микробиологии.
При окраске по этому методу все бактерии подразделяются на грамположительные и грамотрицательные, что облегчает проведение дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний и выбор средств антимикробной терапии.
Окраска состоит из следующих этапов:
1.На фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу, пропитанную раствором генцианвиолета, капают 2 капли воды и оставляют на 2-3 мин.
2.Фильтровальную бумагу убирают, раствор сливают, добавляют раствор Люголя на 1-2 мин., сливают. Водой не промывают!
3.На 15-30 сек. Наносят на мазок 96 % спирт для обесцвечивания мазка, и немедленно промывают препарат водой!
4.На мазок наносят фуксин Пфейффера на 1-2 мин., смывают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под иммерсией.
Сущность метода окраски по Граму состоит в том, что отношение к краскам зависит от химического состава и структурных особенностей клеточной стенки микробной клетки, в частности наличия муреина (пептидогликана) и частично липидов. Грамположительные бактерии прочно удерживают комплекс краски генцианвиолета с йодом (раствор Люголя). Обработка бактерий спиртом вызывает разбухание муреина и уменьшает диаметр пор клеточной стенки, в результате краситель оказывается как бы «запертым» грами воздействие второго красителя не дает видимых результатов. Поэтому грамположительные микроорганизмы, имеющие большое содержание муреина (до 80 %, трехслойная оболочка, наличие тейхоевых кислот), окрашиваются в фиолетовый цвет.
У грамотрицательных микроорганизмов слой муреина тоньше (10-20 %, однослойная оболочка, нет тейхоевых кислот), поры до конца не смыкаются и спирт свободно проникает сквозь клеточную стенку и обесцвечивает бактерию. Они содержат большое количество липидов, которые хорошо растворяются в спирте и способствуют обесцвечиванию микробных клеток, поэтому они окрашиваются в красный цвет
Окраска по Циль-Нильсену
В природе существует группа микроорганизмов, устойчивых к действию кислот, щелочей и спиртов; они относятся к роду Mycobacterium. Среди них встречаются непатогенные(обитающая в сене и впервые обнаруженная в траве–тимофеевке палочка Тимофеевой травы и др.), которые обнаруживают в молоке, масле, кормах, сперме, содержимом кишечника. К патогенным микобактериям относят возбудителей туберкулеза человека и животных, возбудителя лепры.
Кислотоустойчивость объясняется особым химическим составом микробных клеток, в частности, высоким содержанием жировоскоподобных веществ и наличием миколовой кислоты. Эти микробы с трудом воспринимают красящие растворы. Поэтому применяют красители протравители и нагреванием мазка над пламенем. Окрасившись, они прочно удерживают первую краску и не обесцвечиваются при кратковременном воздействии кислоты или спирта.
Метод окраски по Циль-Нильсену:
1.на фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и наносят карболовый фуксин Циля и нагревают до появления паров 2-3 мин.
2.бумагу удаляют пинцетом и на 5 секунд наносят на мазок 5 % раствор серной кислоты.
3.тщательно промывают водой и докрашивают метиленовым синим 2-3 мин.
4.мазок промывают водой, высушивают и смотрят под иммерсией.
Микобактерии окрашиваются в красный цвет, фон (клетки ткани и некислотоустойчивые бактерии) – синий. При воздействии на мазок серной кислоты некислотоустойчивые бактерии легко обесцвечиваются и воспринимают вторую окраску метиленовым синим
Бактериальная спора, эндоспора – непостоянный структурный элемент бактериальной клетки, защищающая ее от неблагоприятных воздействий внешней среды. Споры представляют собой покоящиеся формы прокариот, выдерживающие влияние высокой температуры, ультрафиолетовое облучение, радиации, вакуума, высушивание, действие химических дезинфектантов, растворителей, различного рода токсических веществ и других неблагоприятных факторов, приводящих к гибели вегетативные клетки.
Для окрашивания спор используют специальные, сложные методы окраски, где используются контрастные краски.
Рассмотрим два метода окраски по Пешкову и Виртцу.
Метод Пешкова:
1.Мазок фиксируют, красят метиленовой синькой с подогреванием до кипения, смывают.
2.Докрашивают 1 % водным раствором фуксина Пфейффера в течение 10 секунд, смывают, высушивают.
В результате споры окрашиваются в синий цвет, а бактериальные клетки – в красный.
Метод Виртца:
1.На фиксированный мазок помещают фильтровальную бумагу, смачивают малахитовой зеленью при подогревании над пламенем горелки до появления паров в течение 5 минут.
2.Фильтровальную бумагу убирают, мазок остужают, промывают водой, докрашивают водным раствором сафранина 2 минуты, промывают водой, высушивают на воздухе и изучают под иммерсионной системой.
В результате споры окрашиваются в зеленый цвет, а вегетативные клетки - в красный.
Капсула – это непостоянный структурный элемент бактериальной клетки, она не является обязательной структурой бактериальной клетки: потеря её не приводит к гибели клетки
Для обнаружения капсул применяют специальные методы –, Ольта, Михина.
Метод Михина:
1.На фиксированный мазок наносят метиленовую синь на 5-7 минут и подогревают до появления паров.
2.Краску смывают водой, высушивают мазок на воздухе и смотрят в световой микроскоп под иммерсионной системой.
В результате бактериальная клетка окрашивается в синий, а сама капсула становится бледно розовый цвет.
Метод Ольта:
1.На фиксированный мазок наносят свежий2 %раствор сафранина на 5 –7 минут.
2.Препарат промывают водой, высушивают на воздухе и просматривают в световой микроскоп под иммерсионной системой.
Бактериальная клетка окрашивается в кирпично-красный, капсула в желто- оранжевый цвет.
Жгутики имеются только у подвижных микроорганизмов. Они очень тонкие, т.к. их величина за пределами разрешающей способности светового микроскопа, и они плохо окрашивают, их редко красят. Обычно исследуют на подвижность в живом состоянии. На подвижность исследуют микроорганизмы с опущенным конденсором и затемненном полем зрения. Используют метод висячей и раздавленной капли
Методы подвижности микробов
Метод раздавленной капли. На центр предметного стекла наносят каплю исследуемого материала и накрывают покровным стеклом так, чтобы не появились пузырьки воздуха. Проводят исследование подвижности микроорганизмов под микроскопом. Недостатком данного метода является быстрое высыхание препарата, поэтому при длительном исследовании рекомендуется смазывать края покровного стекла вазелином.
Метод висячей капли. Используют специальные толстые предметные стекла с лункой в центре. Края лунки смазывают вазелином и на центр покровного стекла помещают каплю исследуемого материала. Предметное стекло накладывают на покровное так, чтобы капля находилась в центре лунки. Затем его осторожно переворачивают, и капля свисает в центре герметически закрытой лунки (так капля защищена от высыхания). Недостатком метода являются оптические дефекты из-за толщины стекла и наличия лунки.
Грибы - бесхлорофильные низшие эукариотические организмы. Их используют в хлебопечении, пивоварении, приготовлении кондитерских изделий. Они обогащают почву гумусом, разлагая остатки растений, улучшают питание растений. Грибы используют как продуценты антибиотиков. Также они коррозируют металл, разрушают пластик, картины, книги, приводят к порче продуктов питания и кормов, вызывают микозы и микотоксикозы животных, птиц и человека.
Вегетативное тело грибов - это грибница (мицелий), состоящий из ветвящихся нитей (гифы). По строению мицелия грибы делят на низшие и высшие.
У низших грибов (фикомицеты) мицелий (несептированный) представлен одной разветвленной гигантской клеткой с многочисленными ядрами без перегородок (септ).
У высших грибов в гифах мицелия есть перегородки (септы), разделяющие их на отдельные одноядерные или многоядерные клетки, т.е. мицелий высших грибов септированный.
При бесполом размножении на концах некоторых гиф формируются споры, которые называются конидиями, а гифы, несущие их, - конидиеносцами. У других грибов споры образуются внутри особых клеток, развивающихся на концах гиф. Эти клетки называются спорангиями, а гифы, несущие их, - спорангиеносцами. Созревшие конидии осыпаются, а спорангии лопаются, и из них высыпаются споры, которые в благоприятных условиях прорастают.
При половом размножении сначала происходит слияние двух близлежащих клеток. Затем процесс размножения протекает у различных видов грибов по- разному. У одних образуется клетка, называемая зиготой, которая затем прорастает в новый мицелий; у других грибов образуется плодовое тело, внутри которого развиваются сумки - аски - со спорами. Попадая в благоприятные условия, споры созревают, сумка разрывается, и споры, прорастая, образуют новый мицелий.
Споры грибов очень устойчивы к внешним воздействиям, они могут в течение нескольких лет сохранять жизнеспособность.
У некоторых грибов существуют следующие видоизменения мицелия:
- тяжи, состоящие из параллельно идущих, сплетенных, присоединяющихся анастомозами грибов, не отличающихся друг от друга;
- ризоиды - корешкообразные выросты на мицелии гриба необходимые для прикрепления к субстрату и потребления из него питательных веществ;
- ризоморфыс темноокрашенным плотным наружным слоем гифов, нередко имеющие внутри гифы более крупного диаметра с частично или полностью рас творенными перегородками между клетками, которые выполняют роль проводящих элементов, способствуют распространению гриба по субстрату, снабжению его питательными веществами;
-склероции-удлиненные,округлые уплотнения мицелия,могут сохранять свою жизнеспособность длительное время, а при прорастании дают мицелий;
- псевдопаренхима, или плектенхима, - это ложная ткань, из которой состоят плодовые тела, склероции. Эта ткань формируется путем более или менее плотного сплетения гифов.
Клетка гриба имеет оболочку, протоплазму, ядро и ряд включений. В отличие от бактерий она содержит истинное ядро, а от низших грибов (архимицетов) ее отличает наличие клеточной стенки, в состав которой входит целлюлоза и (или) хитин.
Молодые клетки яйцевидной формы, удлиненные в виде трубочки, зрелые - цилиндрические, при старении клетки могут иметь грушевидную, булавовидную, веретенообразную или амебовидную форму. Оболочка стенки гриба состоит из двух слоев - наружного (хитинового) и внутреннего, образованного из целлюлозы; пространство между ними заполнено полисахаридами.
Непосредственно к целлюлозной части стенки прилегает двухконтурная цитоплазматическая мембрана, с которой находится в тесном контакте эндоплазматический ретикулум, часто гранулярный, составляющий основную часть цитоплазмы. В цитоплазме расположены одно или несколько ядер округлой, овальной или неправильной формы, окруженных собственной оболочкой с порами, и ядрышко, содержащее в составе хромосом ДНК. В клетках могут накапливаться различные продукты метаболизма грибов - антибиотики, ферменты, витамины, токсины и др.
Классификация
При определении класса грибов учитывают строение грибницы и органов размножения. По принципу строения органов размножения все грибы делят:
-Архимицеты, или простейшие грибы, - вегетативное тело представлено комочком протоплазмы (без оболочки), реже зачаточным мицелием. Они чаще ведут водный образ жизни и в основном являются паразитами водорослей. Насчитывается более 300 видов.
-Фикомицеты- мицелий без перегородок, одноклеточный, хорошо развитый, размножение
осуществляется бесполым и половым путями. Среди этого класса, объединяющего около 700 видов, встречаются сапрофиты и паразиты. Сюда относятся мукоровые грибы.
-Оомицеты- грибы с несептированным мицелием. Одни виды обитают в воде, другие в почве. Оомицеты - это совсем небольшой класс низших грибов, включающий порядка 70 родов и 570 видов, обладающих вегетативным телом, с хорошо развитым одноклеточным или же неклеточным многоядерным и слабоветвящимся мицелием, не имеющим ни каких перегородок, (кроме как отделяющих репродуктивные органы) и формирующим у неких примитивных форм - плазмодий (это простейший организм в виде комка слизи). Клеточная стенка содержит целлюлозу, а не хитин, как у настоящих (высших грибов) и основные запасные вещества её - это глюкан и миколаминарин, а биосинтез лизина происходит в ней как у растений. Оомицетыразмножаются как бесполым, так и половым путём.
-Базидиомицеты объединяют более 20 000 видов. Основным органом размножения служит базидия с базидиоспорами. Представителями этого класса являются съедобные и ядовитые шляпочные грибы,деревообразующие грибы, головня и ржавчинные грибы.
- Дейтеромицеты - несовершенные грибы. Обладают многоклеточным мицелием, но не имеют ни сумчатого, ни базидиального спороношения, а лишь конидии. Размножение бесполое.
Это триходерма, альтернария, кандида, микроспориум.
- Аскомицеты или сумчатые грибы, а это самый большой класс грибов, объединяющий организмы с септированным (разъединённым на части) мицелием (грибницей) и специфическими органами спороношения - асками (или сумками) и имеющий возможность полового и бесполого спороношения, причём, во многих случаях, утрачивая половой процесс полностью и тогда, такие виды грибов относятся уже к классу дейтеромицетов, которые входят в отдел несовершенных грибов. К аскомицетам относят около 2-х тысяч родов и больше 30-ти тысяч видов грибов, что составляет, примерно, 30% от всех известных в природе грибов. Среди них и грибы-дрожжи(подкласс сахаромицеты - вторично одноклеточные организмы (рисунок 31). У аскомицетов есть свой, характерный для них, орган полового спороношения - аск, перед возникновением которого и происходит сам половой процесс с образованием у большинства видов 8-ми аскоспор (спор полового размножения). Но, кроме полового размножения с процессом образования аскоспор, у сумчатых грибов существуют ещё другие способы размножения, как например:
-бесполое размножение, при котором сам процесс осуществляется с помо- щью последовательно отчленяющихся от концов гиф конидий(органов бесполого размножения);
-вегетативное размножение, которое происходит путём разделения на части их мицелия (грибницы).
Культивирование грибов
Культивирование грибов производится в аэробных условиях при температуре 22-37 °С на питательных средах, содержащих азотистые и углеродсодержащие вещества; наиболее благоприятный рН 6,0-6,5, но патогенные грибы могут расти и при более широком диапазоне рН - от 3 до 10.
Патогенные грибы нуждаются в различных факторах роста (витамины, аминокислоты) и микроэлементах (цинк, кобальт, соли железа, натрия, магния, меди, фосфора).
По характеру роста на питательных агаровых средах патогенные грибы подразделяют на ряд типов:
- кожистые, гладкие, плотной консистенции, с трудом отделяемые от питательного субстрата;
- пушистые, рыхлые, ватообразной консистенции, с большим трудом отделяемые от питательной среды;
-бархатисто-ворсистые колонии, покрытые очень коротким густым мицелием;
-хрупкие, пленчатые, напоминающие ломкий картон, густомучнистые при
спорообразовании;
3) гипсовидно-мучнистые поверхностные колонии порошковиднойконси- стенции;