Мясо-пептонный полужидкий агар готовят так же, как и МПА но агар-агара добавляют меньше – 0,2 %.
Мясо-пептонный желатин (МПЖ). К МПБ добавляют 10-20 % желатина (продукт, получаемый из клейдающих тканей животных), расплавляют и в горячем виде устанавливают нужную реакцию среды, пропускают через ватно- марлевый фильтр, разливают в пробирки, стерилизуют текучим паром дробно. На рисунке 40 представлены различные формы разжижения желатина.
Молоко – натуральная естественная питательная среда. Цельное молоко обезжиривают центрифугированием, разводят водой 1:1, устанавливают рН 7,0-7,3 с помощью питьевой силы. Молоко стерилизуют дробно текучим паром 3 дня в автоклаве при 110 °С 20 мин. При изучении редуцирующих свойств микробов перед стерилизацией добавляют 2 % раствор метиленового синего из расчета 2 мл краски на 100 мл среды.
Специальные питательные среды
Анаэробы –большая группа микроорганизмов,которые растут и размножаются при отсутствии кислорода воздуха. Анаэробный тип дыхания менее продуктивный, чем аэробный, поэтому питательные среды для анаэробов должны быть богаче питательными субстратами и витаминами. Для удаления из сред кислорода в них помещают кусочки печени, головного мозга, почек. Тканевые клетки обладают редуцирующими свойствами, т.е. активно поглощают и адсорбируют на себе кислород, в результате чего в среде создаются анаэробные условия. Среды в пробирки разливают высоким столбиком в объеме 10-12 мл. Кислород воздуха диффундирует обычно на расстоянии 1-2 см от поверхности, а в глубине создаются анаэробные условия.
Мясо-пептонный печеночный бульон Китта- Тароцци - жидкая среда для культивирования анаэробов. Печень крупного рогатого скота нарезают мелкими кусочками, заливают водой 1:1, кипятят, фильтруют и печеночную воду добавляют к МПБ 2:1 (на 2 л МПБ 1 л печеночного отвара), кипятят, устанавливают рН, разливают по пробиркам высоким столбиком, в которые предварительно положены кусочки вареной печени. В пробирки поверх среды наливают 1-2 мл вазелинового масла и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. 30 мин.
Сахарно-кровяной агар Цейсслера (специальная обогащенная среда для анаэробов). Готовят 3 % МПА и добавляют 2 % глюкозы и 10-20 дефибринированной крови, подсушивают 4-6 часов в термостате и используют.
Методы создания анаэробных условий
1.Физические методы:
- основной и наиболее часто применяемый метод - выращивание культур анаэробов в специальных приборах –анаэростатах, из которых откачивается воздух с помощью механического насоса. В анаэростатах создается отрицательное давление, уровень которого контролирует манометр. Чашки с посевами на поверхности среды помещают в анаэростат вверх крышкой, герметично закрывают крышку анаэростата и откачивают воздух. Анаэростат помещают в термостат. Учет роста проводят через 1-2 дня.
-выращивание микроорганизмов в глубине питательной среды, разлитой «высоким столбиком». При таком способе культивирования среды часто подвергают дополнительной обработке: прогревают питательные среды на водяной бане для удаления растворенного кислорода; наслаивают на поверхность питательной среды вазелиновое масло, расплавленный парафин и другие компоненты, не пропускающие воздух.
2.Химические методы, основанные на поглощении свободного кислорода воздуха в результате химических реакций. Реактивы (гипосульфит натрия и гидроксид калия) смешивают, слегка увлажняют водой и в открытой чашке ставят на дно специального стеклянного сосуда с плотно закрывающейся крышкой – эксикатора непосредственно перед размещением В ней чашек с посевами.
3.Биологические методы – совместное выращивание культур аэробов и анаэробов. Применяют крайне редко. В чашку Петри наливают сахарно-кровяной агар. После застывания агара посредине чашки в питательной среде вырезают канавку шириной 1-1,5 см, которая делит питательную среду на две половинки. Одну из них засевают культурой аэробов (чудесная или кишечная палочка), другую – анаэробов. Для предупреждения поступления кисло- рода извне крышку заклеивают лейкопластырем.Чашки с посевами устанавливают в термостате вверх дном. Быстрорастущие аэробы, поглощая кислород, создают условия для роста анаэробов.
Сахарный (глюкозный) бульон (или агар) изготавливают как обычные среды, но к ним добавляют 1-2 % глюкозы и стерилизуют текучим паром или автоклавируют при 0,5 атм.
Сывороточный бульон и сывороточный мясо-пептонный агар готовят путем асептического добавления к МПБ или расплавленному и охлажденному до 45- 50° МПА 5-10 % стерильной сыворотки крови лошади (барана, кролика), затем сывороточный бульон разливают в стерильные пробирки (колбы).
Среда Петраньяни (среда для выращивания микобактерий туберкулеза)содержит цельное молоко, пептон, крахмал, поваренную соль, картофель, кури- ные яйца, желток,глицерин, малахитовая зелень.
Дифференциально-диагностические среды
Кровяной МПА применяют для выявления гемолитических свойств бактерий. Дефибринированную кровь (5-10 %) стерильно добавляют к расплавленному и остуженному МПА, легким вращением колбочки равномерно смешивают и разливают в стерильные чашки Петри.
Среды Гисса. В пептонную воду (состоящую из дистиллированной воды, 0,5% NaCl и 1 % пептона) добавляют 0,5 % углевода (сахар или многоатомный спирт) и 0,5 % индикатора Андрэдэ (0,5 г кислого фуксина, 16 мл 4 % NaOH, 100 мл дистиллированной воды). Среды с углеводами разливают в пробирки с «газовичками» (поплавками), опущенными в пробирки вверх дном. Стерилизуют среды с углеводами текучим паром дробно. Среды Гисса могут быть жидкие и полужидкие (без газовок), содержащие 0,25 % агара. При ферментации того или иного углевода микробом, растущим в данной среде, образуется кислота, под действием которой восстанавливается цвет краски индикатора. Среда приобретает красный цвет. Образовавшиеся при ферментации углевода газообразные продукты скапливаются в поплавках.
Среда Эндо. В расплавленный МПА вносят 0,5-1 % лактозы и 0,5 % насыщенного спиртового раствора основного фуксина, обесцвеченного добавлением по каплям 10 сернокислого натрия. Среду кипятят и разливают в чашки Петри. Бактерии, сбраживающие лактозу, на этой среде растут в виде красных колоний, а лактозонегативные образуют светло-розовые колонии.
Среда Левина. Содержит питательный МПА, лактозу, индикатор щелочной эозин, метиленовый синий. Цвет среды коричнево- фиолетовый (цвет гнилой вишни). Лактозоположительные бактерии образуют темно-фиолетовые или черные колонии, лактозоотрицательные–серовато- голубые прозрачные колонии.
Среда Плоскирева – основные компоненты сре ды: питательный МПА, лактоза, соли желчных кислот, кальцинированная сода, бриллиантовый зеленый, йод. Индикатор среды нейтральный красный. Цвет розово-желтый. Лактозоположительные бактерии образуют ярко розовые, брусничного цвета колонии, лактозоотрицательные – бесцветные серо- желтые колонии, среда вокруг которых желтеет.
Висмут-сульфит агар (среда Вильсон-Блера). Среда для сальмонелл и выделения анаэробов из объектов внешней среды. Непрозрачная среда молочно-мутного цвета с зеленоватым оттенком. Дифференцирующее действие этой среды зависит от способности бактерий образовывать сероводород, который в химической реакции с сульфитом висмута дает висмут черного цвета. В результате образуются колонии черного цвета. Бактерии, не образующие сероводород, вырастают в виде мелких бесцветных или зеленовато-коричневых колоний.
Применяют также среды с химическими веществами, которые изменяют окраску в результате окислительно-восстановительных (редуцирующих) процессов, обусловленных ферментами бактерий. Для этого готовят молоко с метиленовой синькой. Свежее обезжиренное коровье молоко подщелачивают двууглекислым натром до слабощелочной реакции по лакмусовой бумажке, добавляют 1 % водный раствор метиленовой синьки до голубого окрашивания. Стерилизуют текучим паром дробно.
Среды накопления (обогащения)
Среда Шустовой. К МПА добавляют 10 % 50 % водного раствора гипосульфита и 2 % раствора Люголя. Применяют для накопления бактерий паратифа.
Среда Раппопорт. К МПБ добавляют 1 % глюкозы, 10 % желчи и 1 % индикатора Андрэде. Стерилизуют текучим паром.
Синтетические среды
Применяют для изучения метаболизма бактерий и других биологических особенностей. Их составляют из химически чистых растворимых в воде веществ, в строго определенных количествах. Например, среда Сотона.
Для культивирования дрожжей и плесневых грибов используют среду Сабуро – на 100 мл воды добавляют глюкозы - 4 г, пептона - 1 г, агара - 1,8 г. Стерилизуют автоклавированием
Микробиология — наука о жизни мельчайших, не видимых невооруженным глазом организмах, названных микроорганизмами или микробами. Их можно рассмотреть только с помощью светового или электронного микроскопа.
Мир микроорганизмов сложен и разнообразен. Они широко распространены в природе. Они бывают полезными и вредными: одни из них разлагают остатки растений, трупы животных и тем самым очищают нашу Землю, другие после проникновения в живой организм вызывают болезни, причиняющие огромный вред человеку, животным и растениям.
Микробиология изучает строение, физиологию, биохимию, генетику и экологию микроорганизмов, их роль и значение в природе, в частности в жизни человека, животных. Своим успешным развитием микробиология обязана в первую очередь достижениям физики и химии, которые обогатили микробиологию оригинальными методами исследования.
В свою очередь, микробиология внесла ценный вклад в генетику, биохимию и молекулярную биологию. Микробиологи научились использовать широкие возможности клеток микроорганизмов и заставили их «работать» для получения нужных нам продуктов. Этим занимается микробиологическая промышленность, являющаяся стержнем современной биотехнологии. Принципиально новые возможности биотехнологии открываются с использованием методов генетической инженерии. Микроорганизмы, созданные методом генной инженерии, начинают производить вещества, им не свойственные, но нужные человеку.
Без всякого сомнения, сельское хозяйство XXI века будет кардинальным образом отличаться от прошлого, благодаря широкому внедрению достижений биотехнологии и генной инженерии.
Микробиология включает в себя ряд самостоятельных дисциплин: общую, медицинскую, ветеринарную, промышленную, сельскохозяйственную, космическую и др. Отрасли микробиологии: бактериология, микология, вирусология и др.
Среди других биологических дисциплин иммунологияявляется относительно молодой наукой. Она изучает генетические, молекулярные и клеточные механизмы реагирования организма на чужеродные субстанции, в том числе на микроорганизмы.
Возникновение микробиологии как науки стало возможным после изобретения микроскопа. Первым, кто увидел и описал микроорганизмы, был голландский натуралист Антони ван Левенгук (1632–1723], который сконструировал микроскоп, дававший увеличение до 300 раз. Он установил наличие шаровидных, палочковидных и извитых форм микробов. Книга «Тайны природы, открытые А. Левенгуком», опубликованная в 1695 г., привлекла внимание ученых и побудила к изучению микроорганизмов.
Открытие Левенгука положило начало возникновению микробиологии. Период с конца XVII в. до середины XIX в. вошел в историю как описательный, или морфологический, который создал условия для перехода к физиологическому этапу в развитии микробиологии. Основоположник его — выдающийся ученый химик Луи Пастер (1822–1895). Первые его работы были направлены на изучение природы брожения, он доказал, что причина брожения и гниения — микроорганизмы, вырабатывающие различные ферменты. Каждый бродильный процесс обусловлен жизнедеятельность специфического возбудителя; гниение вызывается группой гнилостных бактерий, молочнокислый процесс — молочнокислыми бактериями и т. д.
Занимаясь изучением природы заразных болезней, Пастер открыл возбудителя холеры кур, стафилококки, стрептококки, установил этиологию сибирской язвы. В дальнейшем Пастер предложил методы получения вакцин против холеры кур, сибирской язвы, бешенства. С этого времени в микробиологии наступил иммунологический период. Работу Пастера в области иммунологии продолжили И. И. Мечников (1845–1916], Э. Беринг (1854–1917) и П. Эрлих (1854–1915).
Одним из основоположников микробиологии наряду с Пастером был немецкий ученый Роберт Кох (1843–1910). Им разработаны методы микробиологических исследований, были предложены плотные питательные среды, что позволило выделять и изучать чистые культуры микробов. Он применил методы окраски микробов анилиновыми красителями, предложил для микроскопии иммерсионную систему. Кох выявил возбудителей сибирской язвы (1876], туберкулеза (1882], холеры человека (1883).
Начало развитию иммунологии положили знаменитые опыты английского врача Эдуарда Дженнера (1749–1823). Основоположником современной иммунологии является Л. Пастер. Он на основании результатов исследований установил, что организм после встречи с ослабленным возбудителем инфекционных болезней становится невосприимчивым к вирулентным микробам того же вида.
Велика заслуга в развитии микробиологии и иммунологии И. И. Мечникова (1845–1916). Он создал фагоцитарную теорию иммунитета, в основу которой положена способность клеток организма противостоять инородным телам, а также установил антагонизм между молочнокислыми и гнилостными микробами. На принципе антагонизма он обосновал теорию долголетия и предложил для этого использовать простоквашу, которая впоследствии получила название «Мечниковской».
Большое значение в развитии микробиологии имеют работы Н. Ф. Гамалея, Л. С. Ценковского, С. Н. Виноградского, Н. А. Михина и др.
Задачами микробиологии и иммунологии являются: разработка новых и усовершенствование существующих микробиологических методов в биотехнологии, получение микробного белка, микробиологическая очистка канализационных вод, внедрение микробных препаратов, повышающих плодородие почвы.