Введение
Эндогенные регуляторные олигопептиды участвуют в различных проявлениях морфогенеза, влияя на течение жизненно важных процессов в организме человека и животных [Ашмарин И.П., Обухова Н.Ф., 1986, 1994; Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 1996; Тимошин С.С., 2001; Brain S.D., Cox H.M., 2006; Varela N. et al., 2007; Tabata T., Takei Y., 2004]. Одним из активно изучаемых веществ этой группы является древний в филогенетическом отношении ундекапептид, первоначально выделенный из организма пресноводного кишечнополостного животного гидры (Hydra attenuata, современное название - Hydra vulgaris) и поэтому названный пептидным морфогеном гидры - ПМГ [Schaller H.С., 1973; Schaller H.С. et al., 1984]. Строение молекулы ПМГ де-тально изучено, она и ряд аналогов синтезированы в лабораторных условиях [Рубина А.Ю., 1992; Birr C., et al., 1981, Bodenmuller H. et al., 1987; Sakura N. et al., 1987; Schaller H.C., Bodenmuller H., 1981].
ПМГ обнаружен в тканях представителей различных классов, включая беспозвоночных, позвоночных животных [Балобанова Э.Ф., Крещенко Н.Д., 1988; Милосердов Ю.В., 1988; Тирас Х.П., 1988, Fuentes E.J. et al., 1993] и человека [Вараксин А.А. и др., 1987; Трясучева И.Г. и др., 1990; Bodenmuller H. et al., 1980; Sakura H. et al., 1991; Schaller H.C. et al., 1988]. Выделены и охарактеризо-ваны рецепторы ПМГ в тканях животных и человека [Christians S. et al., 1993; Hampe W. et al. 1999, 2000; Jacobsen L. et al., 1996; Kanaki T. et al., 1998; Neubauer K.H. et al., 1990]. ПМГ отнесен к нейропептидам, покольку он влияет рост и дифференцировку нейронов [Чимитдоржиев Ж.Ж., 2001; Kajiwara S., Sato T., 1986; Niemann S., Schaller H.C., 1996; Quach T.T. et al., 1992], а его содержание наиболее высоко в клетках и органах нервной системы как в норме, так и при патологических состояниях, включая опухоли [Вараксин А.А. и др., 1987; Трясучева И.Г. и др., 1990; Ekman R. et al., 1990;.Schaller H.C. et al., 1988; Schawaller M. et al., 1988; Winnikes M. et al., 1992].
В экспериментальных исследованиях установлено влияние ПМГ на органы и клетки сердечно-сосудистой, эндокринной, дыхательной, пищеварительной, репродуктивной систем и кожи [Виноградов В.А. и др., 1987; Ганьчева Е.А. и др., 1997; Казимирский А.Н., 1985; Кривошеев О.Г. и др., 1985; Лебедько О.А., Тимошин С.С., 1994, Лебедько О.А. и др, 1997, 2000; Мурзина Н.Б. и др., 1991; Сазонова Е.Н. и др. 1997; Слепушкин, и др., 1989; Спевак С.Е. и др., 1988; Тимошин С.С. и др., 1997, 1998; Федосеев В.А и др., 1993; Хомичук А.Ю., Тимошин С.С., 1990, 1991, 1997].
Между тем, основная часть морфологических исследований посвящена авторадиографическому изучению влияния ПМГ на активность пролиферации клеток. В этих исследованиях дается лишь общая усредненная оценка изучаемого процесса и не описываются его особенности в различных участках тканей и органов. Влияние ПМГ на структурные и метаболические характеристики тканей остается мало изученным.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Изучить структурно-функциональные изменения эпителия различных органов (роговица, язык, пищевод, щитовидная железа) при воздействии пептидного морфогена гидры.
ЗАДАЧИ, определяющие достижение поставленной цели:
1. Гистологическая и морфометрическая оценка влияния пептидного морфогена гидры на структуру эпителиальных тканей различных органов: роговицы, языка, пищевода, щитовидной железы;
2. Характеристика метаболических изменений, вызываемых пептидным морфогеном гидры, в эпителиях указанных органов при использовании гисто-химических методов выявления ферментов с количественной цитофотометрической оценкой;
3. Изучение изменений пролиферативной активности эпителиев при воздействии пептидного морфогена гидры с использованием метода авторадиографии.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ. В проведенной работе при изучении эпителиев различных органов подтверждено ранее установленное стимулирующее влияние ПМГ на пролиферацию эпителиальных клеток. Выявлены не описанные особенности митогенного эффекта ПМГ на эпителиоциты, расположенные в различных топографических зонах в пределах единого эпителиального пласта в одном органе (периферия и центральные участки в роговице, дорсальная и вентральная поверхности языка, эпителий нитевидных сосочков и между сосочками на дорсальной поверхности языка).
Получены новые данные о влиянии ПМГ на архитектонику эпителиального пласта и соотношение толщины слоев в эпителиях различных органов, неодинаково выраженные в конкретных топографических зонах. При количественном анализе гистоэнзимологических характеристик эпителиев выявлено ранее не описанное стимулирующее влияние ПМГ на метаболическую активность покровных и железистых эпителиев, неодинаково выраженное в отдельных топографических зонах органов и слоях многослойных эпителиев. Впервые установлено, что под влиянием ПМГ существенно усиливается гетероморфия и гистоэнзимологическая неоднородность эпителиев.
Впервые изучено влияние пептидного морфогена гидры на морфофункциональные характеристики эндокринного органа - щитовидной железы. Получены новые данные о его стимулирующем действии на функционально ведущую ткань железы - эпителий, которые свидетельствуют о повышении функциональной активности органа.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Результаты проведенного исследования представляют теоретический научный интерес, так как они расширяют существенные представления о влиянии на структуру и функции эпителиальных тканей млекопитающих особого класса биологически активных регуляторных молекул - пептидных морфогенов, в частности, одного из наиболее древних в филогенетическом отношении пептидов - ПМГ. Полученные данные указывают на сложную организацию изученных эпителиальных тканей, которая проявляется неодинаковой чувствительностью к воздействию ПМГ топографически различных участков эпителия, расположенных даже в пределах единого пласта в одном органе. Практическое значение полученных данных заключается в возможности разработки фармакологических препаратов на основе пептидного морфогена гидры (или его аналогов) для использования с целью стимуляции регенерации эпителиальных тканей, заживления ран и лечения хронических заболеваний.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
1. В покровных многослойных эпителиях роговицы, языка и пищевода при воздействии ПМГ наблюдается увеличении толщины эпителиального пласта: в роговице отмечено ее нарастание от периферии к центру, в языке - на дорсальной поверхности в области между сосочками и на вентральной поверхности, в пищеводе - значимое увеличение толщины всего эпителиального пласта.
2. В железистом эпителии щитовидной железы введение ПМГ вызывало увеличение относительного содержания эпителия при снижении относительного содержания коллоида. Показатель степени фолликулярной организации щитовидной железы не изменился, а показатель активности - увеличился.
3. В эпителиях роговицы, языка, пищевода и щитовидной железы при воздействии ПМГ выявлено увеличение всех показателей, характеризующих пролиферативную активность - митотического индекса, индекса меченых ядер и интенсивности метки, выраженность которого зависит от топографических особенностей эпителия.
4. В эпителиях роговицы, языка, пищевода и щитовидной железы ПМГ вызывает усиление метаболической активности, неодинаково выраженное в отдельных слоях и топографических зонах эпителиального пласта.
1. Материал и методы исследования
олигопептид эндогенный гидра пролиферативный
Опыты поставлены на 94 нелинейных взрослых мышах-самцах (питомник «Рапполово») с массой тела 2025 г и 35 нелинейных взрослых крысахсамках (питомник Дальневосточного государственного медицинского университета) с массой тела 100120 г. Животным экспериментальных групп ПМГ вводили внутрибрюшинно 5кратно с интервалом 24 ч из расчета 100 мкг на 1 кг массы тела [Хомичук А.Ю., Тимошин С.С., 1991]. Препарат синтезирован в Лаборатории синтеза пептидов Института экспериментальной кардиологии Российского Кардиологического научнопроизводственного комплекса Росздрава (Москва) и любезно предоставлен для проведения экспериментов руководителем лаборатории к.х.н. Ж.Д. Беспаловой. Животным контрольных групп с той же кратностью вводили стерильный изотонический раствор натрия хлорида. Животных умерщвляли декапитацией под лёгким эфирным наркозом через 24 ч после очередной инъекции ПМГ. Содержание животных, проведение экспериментов и выведение животных из эксперимента осуществляли в соответствии с приказом Минздрава СССР №755 от 1997г, а также правилами, утверждёнными этическим комитетом СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова. Для авторадиографического исследования крысам за 1 ч до забоя однократно внутрибрюшинно вводили 3Нтимидин с удельной активностью 84 Ки/моль в дозе 0,6 мкКи/г. Животным на поверхность роговицы дополнительно наносили 5 мкКи 3Нтимидина трижды в течение часа с интервалом в 20 мин [Хомичук А.Ю., Тимошин С.С., 1991].
Гистологическое исследование роговицы, языка, пищевода, щитовидной железы проводили на серийных срезах, визуально оценивая общее состояние органов с учетом конкретных топографических зон: толщину эпителиального пласта, соотношение его слоев, тинкториальные характеристики, форму и взаимное расположение эпителиоцитов, их ядерно-цитоплазматическое соотношение, состояние ядерного аппарата, выраженность гетероморфии.
Морфометрическое исследование многослойных плоских эпителиев роговицы, языка и пищевода включало определение общей толщины эпителиального пласта и толщины отдельных его слоев [Автандилов Г.Г., 1990] с помощью линейного окулярного микрометра при увеличении 630. На поперечных срезах щитовидной железы проводили стереологическую оценку относительных объемов, занимаемых в органе эпителием (Е), в том числе его фолликулярным (Еf), интерфолликулярным (Ei) компонентами и коллоидом (С). На основании этих результатов определяли соотношения Еf/Ei и Е/С - показатели фолликулярной организации и активности щитовидной железы, соответственно. Измерения выполняли стереологическим методом точечного счета с тестсеткой окулярного микрометра с 25 точками; в ходе исследования учитывали данные, полученные при регистрации 1000 точек. [Быков В.Л., 1979]. Митотическую активность эпителиоцитов исследовали на тотальном препарате роговицы, а также на поперечных срезах роговицы, языка, пищевода и долей щитовидной железы. Оценивали митотический индекс, просматривая в среднем не менее 3000 клеток у каждой мыши на 5 срезах.
Гистохимическое исследование. На криостатных срезах материала, замороженного в жидком азоте, толщиной 10 мкм выявляли ряд ферментов, характеризующих метаболическую активность эпителиоцитов изучаемых органов: НАДН-диафоразу, сукцинат (СДГ) и лактатдегидрогеназу (ЛДГ). Активность ферментов оценивали цитоплазме клеток эпителия на спектроцитофотометре плаг-методом при увеличении 280, площади зонда 0,785 мкм2 и длине волны 545 нм, выражая результаты в относительных единицах оптической плотности (D) [Агроскин Л.С., Папаян Г.В., 1977; Быков В.Л., 1979]. Для многослойных эпителиев измерения проводили, учитывая по 100 клеток в базальном и шиповатом слоях на каждом из 5 срезов. Замеры D в щитовидной железе проводили в 100 тироцитах, исследуя по два тироцита в каждом фолликуле, расположенных друг против друга.
Авторадиографическое исследование проводили на парафиновых срезах толщиной 67 мкм. Для этого срезы тканей роговицы и языка депарафинировали и покрывали фотоэмульсией НИИХИМФОТО, после экспозиции препараты обрабатывали проявителем D19, фиксировали 33% раствором тиосульфата натрия, промывали водой и окрашивали гематоксилином ЛиллиМайера. Подсчитывали индекс меченых ядер (ИМЯ), который определяли как соотношение меченых ядер, над которыми было не менее 5 зерен серебра, к общему количеству ядер [Епифанова О.И. и др., 1977]. Определение ИМЯ проводили на основании просмотра не менее 3000 клеток у каждого животного. Интенсивность метки, (ИМ) отражающую скорость синтеза ДНК, оценивали путем подсчета зерен серебра над 25 мечеными ядрами. Подсчет производили в генеративных зонах исследуемых тканей [Хомичук А.Ю., 1995] при увеличении 630.
Статистическая обработка количественных данных проведена с использованием программного пакета Statistica for Windows V6.0. Для каждого показателя определяли среднее значение и ошибку средней арифметической; различия величин показателей оценивали с помощью критерия Стьюдента, считая их значимыми при Р<0,05.
2. Результаты исследования и их обсуждение
Изменение структурно-функциональных показателей эпителия роговицы при воздействии пептидного морфогена гидры. Гистологическое строение многослойного плоского неороговевающего эпителия роговицы исследованных животных, а также данные о ее толщине у животных контрольной группы полностью соответствуют приведенным в литературе [Collinson J.M. et al., 2004; Gipson I.K., Sugrue I.P., 1994]. Средняя толщина эпителия роговицы мышей составляет 30,2 ± 0,09 мкм, она выше в центральных участках роговицы (33,1 ± 0,17 мкм) по сравнению с периферическими (25,4 ± 0,23 мкм).
При введении ПМГ происходило выявляемое визуально и подтвержденное морфометрическим исследованием увеличение толщины эпителиального пласта (в среднем на 40%), преимущественно за счет 2-кратного утолщения шиповатого слоя (с 15,1 ± 0,07 до 30,3 ± 0,12 мкм), что указывает на увеличение пула дифференцирующихся клеток. В центральных участках роговицы нарастание толщины эпителия было более выраженным (в 1,6 раза), чем в периферических (в 1,2 раза), тем самым, введение ПМГ вызывало усиление имеющейся в норме зональной гетероморфии ткани. Гетероморфия является характерным признаком архитектоники роговицы, закономерности которой описываются так называемой «X-Y-Zгипотезой» [Thoft R.A., 1983], и, вероятно, служит отражением расположения генеративных зон эпителия в наиболее периферических участках и центростремительного перемещения клеток, которое сочетается с их вертикальной миграцией [Димент А.В., Лебедева Г.С., 1973; Cotsarelis G. et al., 1989; Haddad A., 2000].
Нарастание толщины пласта эпителия связано с усилением митотической активности в ответ на введение ПМГ, которое зарегистрировано нами как на гистологических срезах и тотальных препаратах при проведении подсчета митозов, так и методом авторадиографии. МИ значимо увеличивался в среднем с 10,1 ± 0,08 до 13 ± 0,19‰. При этом в центральных участках роговицы он возрастал менее резко (в 1,2 раза с 9,5 ± 0,09 до 11,4 ± 0,15‰), чем периферических (в 1,5 раза с 10,2± 0,22 до 15,3± 0,07‰). ИМЯ в роговице крысы после введения ПМГ значимо увеличивался в 1,3 раза с (9,7 ± 0,27 до 12,9 ± 0,65‰), ИМ также значимо увеличивалась в 1,3 раза (с 13,8 ± 0,11до 17,6 ± 0,18).
Полученные нами данные согласуются со сведениями об общем стимулирующем влиянии ПМГ на процессы пролиферации в эпителии роговицы [Тимошин С.С. и др.1997; Хомичук А.Ю., Тимошин С.С., 1990; 1991]. Вместе с тем, нами впервые отмечены топографические различия, связанные с зональностью роговицы. Поскольку описанный эффект наблюдался нами и другими авторами в роговице мышей и крыс, очевидно, что он не является видоспецифичным.