Внедрение.
Результаты исследования внедрены в научную и практическую работу отдела клинической электрофизиологии и рентгенхирургических методов лечения нарушений ритма сердца НИИ клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ «РКНПК» Министерства здравоохранения РФ.
Апробация работы.
Материалы доложены на межотделенческой конференции НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова «РКНПК» Министерства здравоохранения РФ по апробации кандидатских диссертаций 31.10.2012 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.
Материалы диссертации были представлены на:
1. Конгрессе International Congress of Cardiology, Гонконг, апрель 2013 г.
2. Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной кардиологии», Томск, март 2013.
Объем и структура работы.
Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 190 публикации отечественных и иностранных авторов. Работа содержит 22 таблиц и 19 рисунков.
Материал и методы исследования.
В исследование включали пациентов в возрасте от 18 лет до 70 лет с документированной частой ЖЭ без признаков органической патологии ССС по данным клинико-инструментального обследования.
Предварительное обследование включало в себя общеклинический и биохимический анализы крови, общий анализ мочи, определение концентрации Т4 и ТТГ в сыворотке крови, регистрацию ЭКГ в 12-ти отведениях, проведение эхокардиографического исследования, суточного мониторирования ЭКГ по Холтеру и велоэргометрии по стандартному протоколу Брюса.
Критериями исключения из исследования: 1) недостаточность кровообращения 1-4 ф.кл. NYHA; 2) ИБС; 3) гипертоническая болезнь более 2 степени по классификации ВОЗ от 2008г; 4) дисфункция синусового узла; 5) атриовентрикулярная блокада II и III степени; 6) имплантированный электрокардиостимулятор; 7) острые инфекционные и воспалительные процессы и/или хронические воспалительные процессы в стадии обострения; 8) злокачественные новообразования; 9) коллагенозы: ревматизм, системная красная волчанка, склеродермия и др.; 10) заболевания почек с нарушением их функций - развитие признаков почечной недостаточности (снижение клубочковой фильтрации < 60 мл/мин); 11) заболевания печени с нарушением ее функций - развитие признаков печеночной недостаточности (повышение уровня печеночных ферментов в 3 раза и более); 12) заболевания эндокринной системы; 13) заболевания органов дыхательной системы: бронхиальная астма, хроническая обструктивная болезнь легких и др.; 14) заболевания пищеварительной системы, в том числе язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки; 15) заболевания мочеполовой системы; 16) психические расстройства, алкоголизм, заболевания ЦНС. 17) невозможность отмены на момент проведения обследования седативных и психотропных препаратов, в-блокаторов, антиаритмических препаратов.
Характеристика пациентов, включенных в исследование.
В соответствии с критериями отбора в исследование были включены 91 пациент (27 мужчин и 64 женщины, средний возраст 36,53±11,49 г) с ЖЭ не ниже II градации по Lown, у которых по данным клинико-инструментального и лабораторного обследования (см. выше) не было выявлено признаков заболевания ССС. Данные ХМ-ЭКГ, ЭХО-КГ этих пациентов представлены в табл.1.
Таблица 1.Общая клиническая характеристика пациентов с ЖЭ (n=91)
Группу контроля составили 31 здоровый доброволец (17 мужчин и 14 женщин, средний возраст 35,06 ± 11,64).
Методы исследования.
Для выявления возможных начальных признаков дисфункции левого желудочка, как проявления латентного заболевания сердца, всем пациентам было выполнено определение уровня NT-pro-BNP с использованием анализатора Elecsys 1000 (Германия).
Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови проводилось методом проточной цитометрии. Гепаринизированную кровь в объеме 100 мкл помещали в пробирки для цитометрии, добавляли по 20 мкл соответствующих моноклональных антител (Beckman Coulter, США) с двойной меткой - флюоресцеин-5-изотиоцианат/фикоэритрин. Пробы инкубировали при комнатной температуре в защищенном от света месте в течение 20 минут, затем помещали в станцию пробоподготовки TQ-Prep (Beckman Coulter, США). Подготовленные пробы анализировали на проточном цитометре Cytomics FC 500 (Beckman Coulter, США). В результате иммунофенотипирования выделяли следующие типы клеток: CD3+ -Т-лимфоциты, CD3+/CD4+ - Т-хелперы, CD3+CD8+ - Т-цитотоксические лимфоциты, CD3-CD(16+56) - NK-клетки, CD3+CD(16+56) - Tnk, CD19+ - В-лимфоциты, CD3+CD25+ - лимфоциты, несущие рецептор к интерлейкину 2, CD3+HLA-DR+-активированные Т-лимфоциты, CD3-HLA-DR+ - активированные В-лимфоциты, NK-клетки, CD3+CD50+ - лимфоциты, несущие молекулу межклеточной адгезии (ICAM), CD3+CD95+- лимфоциты, несущие Fas-рецептор апоптоза; CD4+/CD8+ - иммунорегуляторный индекс.
Исследование уровня высокочувствительного С-реактивного белка (hsСРБ), компонентов комплемента С3 и С4, С1 ингибитора, ревматоидного фактора, б1-антитрипсина, б2- макроглобулина, концентрации иммуноглобулинов А, М, G в сыворотке крови проводили с использованием реактивов Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH (Германия) методом нефелометрии на анализаторе BNProSpec (Dade-Behring Marburg GmbH, Германия)
Определение уровня антител IgМ и IgG к кардиолипину, а так же аутоантител IgG к нативной (двуспиральной) и денатурированной (однонитевой) ДНК проводилось методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест систем компании Orgentec Diagnostika GmbH (Германия). Измерение результатов проводили на планшетном фотометре Anthos-2020 (Anthos Labtec, Австрия). Определение концентрации циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови (ЦИК 3%, ЦИК 4%) проводили методом преципитации полиэтиленгликолем с молекулярной массой 6000Д (ПЭГ-6000). Уровень антител к миокарду определялся методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием наборов Imm Gloanti-Heart-Antibody IFA kit (Immco Diagnostics).
Уровень IgE и эозинофильного катионного белка (ECP) оценивался с использованием анализатора Immulite 1000 ECP и Elecsys 1000 Total IgE.
Определение серологических маркеров инфекций проводили с использованием наборов для ИФА по определению IgМ и IgG в сыворотке человека к Chlamydophila pneumoniae и Mycoplasma pneumoniae (Savyon, Израиль) на планшетном фотометре Anthos-2020 (Anthos Labtec, Австрия). Определение антител IgG Cytomegalovirus, IgG Epstein-Barr virus и IgG Herpes simplex 1,2 типа выполняли с использованием наборов «ДС-ИФА-Анти-ЦМВ-G», «ДС-ИФА-Анти-ВЭБ-VCA-G», «ДС-ИФА-Анти-ВПГ-1,2-G» («НПО диагностик», Россия) на планшетном фотометре Anthos-2020 (Anthos Labtec, Австрия).
Методика получения белков, моделирующих внеклеточную часть в1-АР и М2-ХР.
На основании данных литературы и компьютерного предсказания потенциальных линейных антигенных детерминант для исследований были выбраны фрагменты 1-й и 2-й внеклеточных петель в1-АР: ARI EYGSFFC(Acm)EL (125-133); ARII ARRCYNDPKCC(Acm)DF(206-218); в8 HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNR (197-222);
и М2-ХР: MRI YTVIGYWPLGVVCDL и YTVIGYWPLGVVC(CH2CONH2)DL (83-98); MRII RTVEDGECYIQFFSNAAVTFGTAI и RTVEDGEC(CH2CONH2)YIQFFSNAAVTFGTAI(169-192); MRIII NTFCAPCIPNTV и NTFC(CH2CONH2)PC(CH2CONH2)IPNTV (410 - 421); MRIV VEDGECYIQFFS (171-182). Полипептиды получены в лаборатории синтеза пептидов Института экспериментальной кардиологии РКНПК под руководством Беспаловой Ж.Д. Для синтеза линейных полипептидов применялся твердофазный метод с использованием Fmoc-методологии. Полипептиды получены в ручном варианте по стандартным протоколам твердофазного синтеза и после необходимых постсинтетических процедур очищены до чистоты не менее 95% с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ).
Для создания высокоэффективных синтетических антигенов, наиболее близко повторяющих структуру и антигенные свойства природных антигенов - М2-ХР и в1-АР - были получены два новых конформационных синтетических антигена - «химерные» молекулы, в которых пептидные цепочки, соответствующие разным внеклеточным петлям этих белков, соединены дисульфидными связями. Кроме того, для получения искусственного антигена, наиболее близко повторяющего пространственную структуру 2-й внеклеточной петли в1-АР, была рассчитана структура полипептида в25. Одним из факторов стабилизации этой молекулы являются две дисульфидные связи между двумя парами остатков цистеина Cys209 - Cys215 и Cys199 - Cys220. Химерные молекулы, представляющие собой несимметричные дисульфиды, и пептид в25, представляющий бициклический дисульфид, были получены методами классической пептидной химии в растворе и очищены также с помощью ОФ-ВЭЖХ. Структура пептидов подтверждена данными масс-спектрометрии и 1Н-ЯМР-спектроскопии; гомогенность пептидов подтверждена данными аналитической ВЭЖХ.
Методика иммуноферментного исследования аутоиммунных изменений у больных с ЖНРС без органической патологии ССС.
Определение аутоантител было выполнено в лаборатории иммунохимии, под руководством Ефремова Е.Е методом непрямой реакции ИФА, с использованием ранее синтезированных пептидных последовательностей, моделирующих различные участки в1-АР и М2-ХР. Учет результатов реакции ИФА осуществляли на спектрофотометре «Immunotech LMA01» при длине волны л = 450 нм. Уровень аутоантител определяли как отношение оптической плотности - ОП450 иммуноферментной реакции исследуемого образца к рассчитанной критической оптической плотности - ОПкрит, где ОПкрит = ОПсред + удвоенное стандартное отклонение, где ОПсред- среднеарифметический результат по всем исследуемым сывороткам крови пациентов. Положительными считали образцы, отношение ОП которых к ОПкрит было больше или равно 1,0.
Статистическая обработка.
Статистический анализ данных был выполнен в лаборатории биостатистики под руководством Деева А.Д. Анализ включал стандартные методы описательной статистики: вычисление средних, стандартных отклонений, стандартных ошибок, а также медианы и 25-й и 75-й перцентиль; определение критериев значимости - тест Манна-Уитни и F-критерий Фишера; однофакторный дисперсионный анализ; метод логистической регрессии. Ввод данных, их редактирование и статистический анализ осуществлялись с использованием системы SAS (Statistical Analysis System), версия 6.
Результаты исследования и их обсуждение
Уровни NT-pro-BNP анализировали раздельно у лиц с частой ЖЭ без признаков органической патологии ССС и у лиц группы контроля. У пациентов с ЖНРС показатели NT-pro-BNP в 2 раза превышали результаты, полученные в группе контроля (p<0,001). У пациентов с ЖЭ медиана NT-pro-BNP составила 49,2 пг/мл [22,9; 122,7], a в группе контроля -- 25,4 пг/мл [9,8; 57,2].
У больных с ЖНРС проведен анализ проявлений желудочковой эктопической активности, в зависимости от уровней NT-pro-BNP. Согласно терцилям значений NT-pro-BNP были сформированы 3 группы пациентов:
1 группа - уровень NT-pro-BNP до 50 пг/мл;2 группа - уровеньNT-pro-BNP от 50 до 100 пг/мл;3 группа - уровень NT-pro-BNP был выше 100 пг/мл.
У пациентов со значениями NT-pro-BNP, превышающими 100 пг/мл, зарегистрировано максимальное количество ЖЭ за сутки по данным ХМ-ЭКГ, в том числе эпизодов бигеминии (рис 1).
Кроме одиночных проявлений желудочковой эктопической активности у лиц с высокими показателями NT-pro-BNP (3 группа) достоверно чаще по данным ХМ-ЭКГ регистрировали эпизоды парной ЖЭ, которая не регистрировалась в группе 1, и пробежки ЖТ, зарегистрированные только среди пациентов 3 группы.
Рисунок 1.Выраженность желудочковой эктопической активности в зависимости от уровней NT-pro-BNP. Примечание: 1 группа - пациенты с уровнем NT-pro-BNP менее 50 пг/мл (n=46); 2 группа - пациенты с уровнем NT-pro-BNP от 50 до 100 пг/мл (n=17); 3 группа - пациенты с уровнем NT-pro-BNP более 100 пг/мл (n=28).
Таким образом, у лиц с ЖЭ был зарегистрирован достоверно более высокий уровень NT-pro-BNP по сравнению с группой здоровых добровольцев, сопровождающийся, как ростом общих количественных проявлений желудочковой эктопической активности, так и ростом количества парных ЖЭ и эпизодов ЖТ.
Для проверки гипотезы о возможной роли латентно протекающего воспаления в развитии ЖНРС у лиц, не имеющих клинико-инструментальных признаков заболевания ССС, всем пациентам было выполнено исследование показателей клеточного и гуморального звена иммунного ответа.
При оценке параметров клеточного иммунитета у пациентов с ЖЭ и здоровых добровольцев обнаружены статистически значимые различия по уровням CD19+, CD3+HLA-DR+, CD3-HLA-DR+ и CD3+CD95+. Так, у пациентов с ЖНРС уровень CD3+CD95+ был достоверно выше, чем в контрольной группе (27,78 ±11,68% против 18,69 ± 7,39%, при p=0,001). Схожая картина наблюдалась и в отношении CD3+HLA-DR+ (3,00 ± 1,99% у лиц с ЖЭ против 2,19 ± 1,68 % у здоровых добровольцев), в то время как более высокие показатели CD19+ были зарегистрированы в группе контроля (9,83 ± 3,44% против 12,11 ± 4,44%, где р=0,007).
Таким образом, у больных с желудочковой эктопической активностью без признаков органической патологии CCC по сравнению с контрольной группой определен ряд показателей, свидетельствующих об активации клеточного звена иммунного ответа.
В ходе анализа гуморального звена иммунитета у больных с ЖЭ значимых отклонений от референсных значений диагностировано не было. Кроме того при сравнении с результатами, полученными в группе контроля, также достоверных отличий выявить не удалось.
Однако при разделении всех обследованных больных по уровню СРБ до 2 мг/л (включительно) и более 2 мг/л было обнаружено, что у больных с уровнем СРБ, превышающим 2 мг/л общие количественные проявления желудочковой эктопической активности были выше по сравнению с остальными пациентами (p=0,065) (рис 2), выше было и «бремя» ЖЭ, определенное как процент ЖЭ от общего количества QRS за сутки.
Рисунок 2. Проявления желудочковой эктопической активности у лиц с ЖЭ в зависимости от уровней СРБ. Примечание: 1- группа со значениями СРБ менее 2 мг/л (n=69); 2- группа пациентов со значениями СРБ более 2 мг/л (n=21).
Исходя из полученных результатов, можно предположить, что у ряда пациентов реакции гуморального звена иммунного ответа, в том числе даже незначительное повышение СРБ, могут свидетельствовать о скрытом воспалительном процессе, значимом для возникновения ЖНРС и влияющим на их количественные проявления.