Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Особенности терапии бактериального вагиноза, ассоциированного с Atopobium vaginae, и характеристика выделений из влагалища с использованием ДНК-чипов (клинико-лабораторное исследование)
14.00.11. - Кожные и венерические болезни
Плахова Ксения
Москва - 2007
Работа выполнена в отделении урогенитальных инфекционных заболеваний Федерального Государственного учреждения «Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Федерального агенства по высокотехнологичной медицинской помощи» и Государственном учреждении «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Росздрава»
Научные руководители:
Доктор медицинских наук, профессор Михаил Александрович Гомберг
Доктор биологических наук, профессор Вадим Маркович Говорун
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор Елена Валериевна Липова
Доктор медицинских наук Наталья Владиславовна Фриго
Ведущее научное учреждение: Российский Университет Дружбы Народов, г. Москва
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Патологические выделения из влагалища являются одной из ведущих причин обращения женщин к врачу. При обследовании у таких пациенток часто обнаруживают инфекции, передаваемые половым путем (ИППП), в этом случае тактика врача достаточно полно определена в соответствующих рекомендациях. Значительно сложнее ситуация обстоит с пациентками, обратившимися с жалобами на выделения из влагалища, при которых отсутствует безусловный патогенный микроорганизм, а также грибы рода Candida. Классическим примером таких состояний и ведущей по частоте причиной патологических выделений из влагалища является нарушение нормального микробного состава вагинального содержимого - бактериальный вагиноз (БВ). БВ обнаруживают по разным данным у 4,9% - 36% пациенток с выделениями, включая 20-25% среди беременных (Европейское руководство по заболеваниям, передаваемым половым путем, 2004), регистрируется в 17-19% случаев среди обратившихся в клиники планирования семьи. В структуре заболеваний репродуктивной системы БВ встречается в 40-60% случаев (Тихомиров А.Л. с соавт., 2004; Morris M. etc., 2001). Этиологические агенты, приводящие к развитию БВ, до сих пор до конца не изучены, но бесспорной является полимикробная этиология этого состояния.
Наличие БВ у женщин, особенно в течение длительного времени, повышает риск развития воспалительных заболеваний органов малого таза, создает серьезные проблемы после гинекологических оперативных вмешательств. Кроме того, БВ может явиться причиной осложнений беременности и родов, способствуя невынашиванию беременности и преждевременным родам. Описаны случаи, когда БВ приводил к развитию хориоамнионита, послеродового эндометрита, внутриутробного инфицирования плода, перитонита. Есть публикации, свидетельствующие о том, что БВ ассоциирован с инфекцией уретрального тракта, цервицитами (Анкирская А.С. с соавт.; 2001; Кира Е.Ф., 2001; Cu-Uvin S. etc., 2001).
БВ является фактором риска заражения ИППП и ВИЧ-инфекцией. В условиях высоких значений рН возникают благоприятные условия для колонизации мочеполовой системы патогенными микроорганизмами, а также обострению скрыто протекающей вирусной инфекции урогенитального тракта. Смешанные инфекции или инфекции, развившиеся на фоне выраженного дисбаланса состава микроценоза влагалища, наблюдаются в 20-30% случаев клинически выраженных инфекций влагалища (Анкирская А.С. с соавт., 2001; СDC, 2000; Nillson U. etc.,1997; Hashemi F. B.etc., 1999).
БВ негативно сказывается на качестве жизни женщин. Показано, что при наличии длительно существующих и обильных выделений из влагалища у пациенток возможно развитие психосоматических нарушений, у 1/3 - снижается работоспособность, нарушается половая и детородная функции, снижается качество жизни (Кира Е.Ф., 2001).
По данным некоторых авторов особенностью БВ является его склонность к рецидивированию после проведенного лечения, что наблюдают до 50% случаев (Wilson J., 2004, СDC 2000).
Классическими методами лабораторного обследования при постановке диагноза БВ являются культуральное исследование материала, взятого из заднего свода влагалища, и микроскопическое исследование мазка. Однако при исследовании с помощью световой микроскопии невозможно провести видовую идентификацию микроорганизмов, а при культуральном исследовании можно выделить не более 15% микроорганизмов из числа тех, что действительно присутствуют во влагалище при наличии выделений. Методы генодиагностики позволяют решить проблему быстрого и качественного обнаружения любой микрофлоры, как аэробной, так и анаэробной, а также микроаэрофилов непосредственно в мазках.
Цель исследования. С использованием методов генодиагностики (стандартная ПЦР и ДНК-чипы) и бактериологических методов исследования изучить спектр микроорганизмов у пациенток при выделениях из влагалища и на основании полученных данных повысить эффективность проводимой терапии.
Задачи исследования:
1. Апробировать систему идентификации бактериальной микрофлоры влагалища путем универсальной амплификации генов 16 S РНК бактериальных геномов с последующей видовой идентификацией возбудителей путем гибридизации с видоспецифическими зондами (олигонуклеотидный ДНК-чип).
2. Оценить возможность использования ДНК-чипа для относительной оценки количественного соотношения идентифицированных микроорганизмов.
3. Изучить особенности микробиоценоза влагалища с определением аэробной и анаэробной флоры при БВ, в зависимости от длительности течения.
4. Оценить терапевтическую эффективность интравагинального применения метронидазола или клиндамицина при патологических выделениях из влагалища с наличием признаков БВ, в зависимости от идентифицированных микроорганизмов.
Положения, выносимые на защиту:
1. ДНК-чип - динамическая система, которая может быть использована для исследования микробного спектра вагинального содержимого у пациенток с выделениями из влагалища. Использование ДНК-чипа наиболее оправдано при диагностике состояний, когда ожидается обнаружение широкого спектра микроорганизмов, в том числе трудно культивируемых анаэробных. Метод позволяет провести относительную количественную оценку идентифицированных микроорганизмов в исследуемой пробе.
2. Идентификация A.vaginae у пациенток с выделениями из влагалища является дополнительным критерием БВ и прогностическим фактором длительного рецидивирующего течение заболевания.
3. Для лечения БВ, ассоциированного с A.vaginae, приоритетным является назначение клиндамицина интравагинально.
Научная новизна:
1. Впервые в клинической практике апробирована система идентификации микрофлоры влагалища методом ДНК-чипа.
2. Впервые оценена возможность использования ДНК-чипов при постановке диагноза бактериального вагиноза.
3. Впервые путем динамического анализа вагинальной микрофлоры на олигонуклеотидных ДНК-чипах оценен состав микробиоценоза влагалища при БВ, резистентном к терапии.
4. Впервые в России оценена роль A. vaginae при патологических выделениях из влагалища. Установлена высокая корреляция A. vaginae с БВ. Впервые обнаружено, что у всех пациенток с A. vaginae, течение БВ носит длительный рецидивирующий характер.
5. Впервые в России доказана более высокая эффективность интравагинального применения клиндамицина для лечения БВ, ассоциированного с A. vaginae, и БВ, течение которого носит длительный рецидивирующий характер.
Практическая значимость. На основании полученных результатов даны рекомендации по спектру микроорганизмов, целесообразных для включения в ДНК-чип при исследовании вагинального содержимого у пациенток с патологическими выделениями из влагалища. Уточнены рекомендации по прогнозу и ведению пациенток с бактериальным вагинозом, течение которого носит упорный рецидивирующий характер. Даны рекомендации по лечению бактериального вагиноза, ассоциированного с A. vaginae.
Внедрение результатов диссертации в практику. Основанные на результатах диссертации рекомендации используются в клинической работе: ГУЗ НО «Кожно-венерологический диспансер Сормовского района г. Нижний Новгород» и ГКБ № 14 им В.Г.Короленко г. Москвы.
Апробация работы. Основные положения работы доложены на II Всероссийском конгрессе дерматовенерологов, г. Санкт-Петербург, 24-27 сентября 2007 г., а также на школе урогинекологов, 11-12 сентября 2007 г. Одинцово.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.
Структура и объем диссертации: Работа выполнена на 123 страницах машинописного текста и состоит из 5 глав, содержащих введение, обзор литературы, описание методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические рекомендации и список литературы. Список литературы включает 115 зарубежных и российских авторов. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 8 рисунками.
Содержание работы
Материалы и методы исследования. Проведено клинико-лабораторное обследование 120 женщин в возрасте от 17 до 45 лет, обратившихся в клинико-диагностическое отделение ФГУ «ЦНИКВИ Росмедтехнологий». Основную группу составили 100 женщин, обратившихся с жалобами на выделения из влагалища. Из 100 пациенток у 80 (80%) женщин клинически и лабораторно (в соответствии с критериями Амсела) был установлен диагноз - бактериальный вагиноз (I группа), у остальных 20 пациенток признаков БВ обнаружено не было, и как единственно возможная причина патологических выделений при культуральном исследовании были выявлены генитальные микоплазмы (U. urealyticum и /или M. hominis) (II группа). Контрольную группу (III группа) составили 20 здоровых пациенток, обратившихся для профилактического обследования на ИППП, у которых при клинико-лабораторном обследовании патологии выявлено не было. При включении пациенток в исследования учитывались следующие данные.
Критерии включения в основную группу:
1. Возраст от 17 до 45 лет.
2. Жалобы на патологические выделения из влагалища.
Критерии исключения из основной группы:
1 Беременность и лактация.
2 Наличие ИППП в период проведения исследования.
3 Нарушения менструального цикла, дисфункция яичников.
4 Патология эндокринной системы в анамнезе и в период проведения исследования.
5 Системная и местная антибактериальная терапия в течение 1 месяца до начала проведения исследования.
Критериями включения в контрольную группу были: отсутствие признаков ИППП при обследовании и отсутствие местной или системной антибиотикотерапии в течение месяца до проводимого обследования. Пациентки группы I были условно разделены на две подгруппы в зависимости от длительности течения заболевания:
Подгруппа 1 - течение заболевания носило рецидивирующий характер в течение 6 месяцев и более - 36 пациенток.
Подгруппа 2 - с длительностью заболевания менее 6 месяцев - 44 пациентки.
При обследовании пациенток использовали: изучение данных анамнеза, клинический осмотр (осмотр с использованием зеркала Куско, проведение аминного теста, исследование рН вагинального содержимого), микроскопическое и микробиологическое исследование материала, методы молекулярной диагностики (ПЦР, ДНК-чип) и статистическую обработку результатов
При исследовании материала, полученного из заднего свода влагалища, уретры, цервикального канала, осуществляли микроскопию мазка, окрашенного по Граму, культуральное исследование для идентификации патогенных возбудителей, передаваемых половым путём (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis), Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis (на базе отдела лабораторной диагностики ИППП и кожных болезней ФГУ ЦНИКВИ «Росмедтехнологий»). Проводили культуральное исследование на наличие условно-патогенных аэробных и анаэробных микроорганизмов материала, полученного из заднего свода влагалища. Использовали ПЦР-диагностику для исключения Chlamydia trachomatis, ВПГ I и II.
На базе НИИ ФХМ проводился анализ материала из заднего свода влагалища с помощью ДНК-чипов (рис.1) и на первых этапах работы ПЦР-идентификация A. vaginae в исследуемом материале. ДНК-чип включал в себя 41 различный патогенных, условно-патогенных и непатогенных микроорганизм, в ходе работы в спектр исследуемых с помощью ДНК-чипа микроорганизмов был включен 42 - A. vaginae.
Рис.1. Результат сканирования флюоресценциии при исследовании вагинального содержимого с помощью ДНК-чипа (пациентка Н., диагноз: бактериальный вагиноз).
Для количественной оценки результатов, полученных с использованием ДНК-чипов, использована компьютерная программа Totallab.
Пациентки, с установленным диагнозом БВ (n=80) получали лечение по одной из двух следующих схем: гель метронидазол (0,75%) интравагинально по 5 г в течение 5 дней или клиндамицин крем 2% интравагинально по 5 г в течение 6 дней. Выбор схемы лечения осуществляли произвольно. После лечения обследовали 44 пациентки: 50% (n=22; 1-ая подгруппа) получали метронидазол интравагинально и 50% получали клиндамицин интравагинально (n=22, 2-ая подгруппа). Контрольное обследование проводилось не ранее, чем через неделю после окончания лечения, и оценивалось по субъективным (исчезновению жалоб на выделения из влагалища) и объективным признакам (критериям Амсела и иррадикации A. vaginae из вагинального отделяемого).