Автореферат: Особенности терапии бактериального вагиноза, ассоциированного с Atopobium vaginae, и характеристика выделений из влагалища с использованием ДНК-чипов (клинико-лабораторное исследование)

Обработка полученных данных проводилась на персональном компьютере с помощью прикладных программ Microsoft Excel - 98 и Statistika for Windows, программы «Биостатистика». Анализ достоверности результатов исследования определяли с помощью критерия 2 (p<0,05 - различия статистически достоверны) и с помощью критерия Фишера. Для выявления наиболее часто встречающихся ассоциаций микроорганизмов в различных группах проводился кластерный анализ.

Результаты собственных исследований

Средний возраст I, II и III групп составил 27 ± 5,8 лет.

Результаты клинико-анамнестического обследования пациенток с жалобами на выделения из влагалища

По результатам клинико-анамнестического обследования пациенток были выявлены следующие факторы риска развития БВ (при сравнении группы I c группами II и III):

* раннее начало половой жизни (до 18 лет) в 47 (58,7%) случаев (p=0,04);

* абсолютное пренебрежение барьерными методами контрацепции в 29 (36,2%) случаях (p=0,04);

* частая смена половых партнеров (более 10 половых партнеров за жизнь) 23 (28,8%) случая (p=0,04);

* БВ в анамнезе 36 (45%) случаев (p = 0,03);

* применение местных спермицидов в 5 (6,3%) случаях и внутриматочной спирали в 2 (2,5%) случаях.

Данные анамнеза и выявленные факторы риска характеризовали группу пациенток с БВ (группа I) в целом вне зависимости от длительности течения заболевания. При разделении группы на две подгруппы по длительности течения заболевания значимых различий в анамнестических данных и данных клинического обследования выявлено не было. Длительность периода рецидивирования БВ не зависела от выявленных факторов риска развития БВ. Не выявлено достоверного влияния особенностей сексуального поведения и данных гинекологического анамнеза на длительность течения БВ.

Исследование микрофлоры влагалища с использованием культуральных методов исследования.

При обследовании пациенток с жалобами на выделения из влагалища (n=100) с использованием микроскопии мазка, окрашенного по Граму, и культуральных методов исследования было идентифицировано 14 различных условно-патогенных микроорганизмов в сравнении с группой контроля (группа III, n=20), где было идентифицировано 7 различных микроорганизмов. Среди пациенток с БВ (группа I, n=80) c наибольшей частотой был идентифицирован микроорганизм, часто ассоциирующийся с БВ - G. vaginalis в 55 (68,7%) случаях. С несколько меньшей частотой были идентифицированы другие БВ -ассоциированные микроорганизмы: U. urealyticum в 41 (51,5%) случае, Mobiluncus spp. в 30 (37,5%) случаях и M. hominis в 25 (31,2%) случаях. С высокой частотой обнаруживался рост Corynebacterium spp. и Staphylococcus epidermidis в 50 (62,5%) случаях. Причем во II-ой и III-ей группах Corynebacterium spp. также встречался с высокой частотой: 15 (75%) и 11 (55%) пациенток соответственно (p> 0,05). В то время как Staphylococcus epidermidis во II-ой и III-ей группах обнаруживали с достоверно более низкой частотой 6 (30%) и 7 (35%) пациенток соответственно (p=0,004). Так же отмечено, что только в I-ой группе встречался Staphylococcus spp. у 8 (10%) пациенток. Представитель кишечной микрофлоры E. coli встречался с относительно одинаковой частотой во всех трех рассматриваемых группах (p>0,05).

Во II-ой группе, кроме обнаруженных при культуральном исследовании в 100% случаев генитальных микоплазм (U.urealyticum и/или M. hominis), c достоверно большей частотой обнаруживали представителя кишечной микрофлоры Enterococcus faecalis в 14 (70%) случаях (p=0,008 при сравнении с группами I и III). А также с достоверно большей частотой в группе II по сравнению с группой I обнаруживали Staphylococcus saprophyticus в 6 (30%) случаев (р=0,001).

В группах II и III не обнаруживали микроорганизмы, характерные для пациенток с БВ (группа I): G. vaginalis и Mobiluncus spp.

Представители нормальной микрофлоры влагалища - Lactobacillus spp., выявлялись с относительно низкой частотой во всех рассматриваемых группах (p>0,05).

Таким образом, в результате проведения культурального исследования вагинального содержимого, в рассматриваемых группах установлен спектр наиболее часто выявляемых условно-патогенных микроорганизмов:

1. Для группы I (n=80): G. vaginalis, U. urealyticum, Mobiluncus spp., M. hominis, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus spp.

2. Для группы II (n=20): U. urealyticum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus saprophyticus.

3. Часто обнарживались во всех рассматриваемых группах: Corynebacterium spp., E. сoli.

Исследование спектра микрофлоры влагалища и количественного соотношения идентифицированных микроорганизмов с использованием ДНК-чипа.

С использованием ДНК-чипа и стандартной ПЦР был исследован материал (отделяемое заднего свода влагалища), полученный от 45 пациенток с жалобами на выделения из влагалища. В качестве контрольной группы обследовано 8 здоровых по результатам клинико-лабораторного обследования женщин, жалоб на момент обращения не предъявлявших. В материале, полученном от пациенток с жалобами на выделения из влагалища (n=45), с помощью ДНК-чипа нам удалось идентифицировать 29 различных микроорганизмов из 42 возможных, включая трудно-культивируемые анаэробные бактерии. Спектр выявляемой микрофлоры составили как условно-патогенные микроорганизмы, так и микроорганизмы, входящие в нормальный состав микробиоценоза влагалища. В ДНК-чип, который использовали в данном исследовании, наряду с условно-патогенными микроорганизмами было включено три патогенных: N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium. Патогенные микроорганизмы при анализе микробного состава с помощью ДНК-чипа не выявлялись, т.к. наличие ИППП являлось критерием исключения из исследования. Среди 29 выявленных с помощью чипов микроорганизмов обнаруживали различные группы бактерий, в том числе: микроаэрофильные бактерии (G. vaginalis в 30 (66,7%) случаях), облигатно-анаэробные грамположительные и грамотрицательные бактерии (Bacteroides spp. в 37 (82,2%) случаях, A. vaginae в 34 (75,5%) случаях, Lactobacillus spp. в 25 (55,5%) случаях, Clostridium spp. в 9 (20%) случаях, Prevotella spp. в 9 (20%) случаях, Porphyromonas spp. в 8 (17,8%) случаях, Fusobacterium spp. в 7 (15,5%) случаях, Peptostreptococcus spp. в 5 (11,1%) случаях, Mobiluncus spp. в 4 (8,8%) случаях, Veilonella spp. в 3 (6,6%) случаях) и факультативно-анаэробные грамположительные бактерии (M.hominis, U.urealyticum в 15 (33,3%) случаях, Streptococcus spp. в 3 (6,7 %) случаях, Staphylococcus spp. в 1 (2,2%) случае). Идентифицированный спектр микроорганизмов во многом предопределен составом исследуемой группы, в которой из 45 пациенток у 39 (86,7%) был установлен диагноз БВ (согласно критериям Амсела). У 6 (13,3%) пациенток, не имеющих признаков БВ, в качестве единственно возможной причины патологических выделений из влагалища были выявлены генитальные микоплазмы (U. urealyticum и/ или M. hominis) при культуральном исследовании.

При обследовании группы контроля (материал получали из заднего свода влагалища; n=8) с использованием ДНК-чипа было выявлено всего 5 различных микроорганизмов, среди которых чаще всего (в 5 случаях) обнаруживали представителя нормальной микрофлоры влагалища Lactobacillus fermentus.

Среди пациенток I-ой группы (n=80) была выделена подгруппа 1, у которых в анамнезе отмечались рецидивы БВ в течение 6 месяцев и более (n=20), а также подгруппа пациенток, у которых длительность БВ была менее 6 месяцев (подгруппа 2, n=19). Спектр, микроорганизмов, выявленных у пациенток с длительным течением БВ, в целом оказался шире, чем у пациенток с длительностью заболевания менее 6 месяцев. Обращало на себя внимание, что A. vaginae в этой подгруппе выявляли с достоверно более высокой частотой - в 100% (p=0,02) по сравнению с подгруппой 2. Также в подгруппе 1 суммарная частота идентифицированных представителей рода Bacteroides spp. достоверно выше, чем в подгруппе 2 (р=0,047). Кроме того, при более длительном течении БВ достоверно чаще встречались генитальные микоплазмы (p=0,003).

Таким образом, использование ДНК-чипов позволило не только поставить диагноз БВ, но и установить факторы длительного течения БВ - микроорганизмы, обнаружение которых может свидетельствовать о длительном, рецидивирующем течении заболевания:

1. Atopobium vaginae при длительном течении БВ обнаружен в 100%;

2. Bacteroides spp. при длительном течении БВ обнаружены в 75%;

3. Генитальные микоплазмы (U. urealyticum и / или M. hominis) при длительном течении БВ обнаружены в 50%.

Относительная оценка количественного соотношения микроорганизмов, выявленных в исследуемых образцах, проводилась по определению интенсивности положительного сигнала (степени свечения). Это позволяло косвенно оценивать соотношение, выявленных микроорганизмов (рис. 2). На диаграмме видно, что самый интенсивный сигнал, соответствует зонду All, который принят за контрольный и за 100 %. Наибольшие положительные по интенсивности результаты соответствуют Porphyromonas asacchoralytica, G. vaginalis и Bacterоides distasionis занимают в этой пробе 70%, 58% и 55% соответственно. С наименьшей интенсивностью выявляли Lactobacillus spp., Enterococcus faecalis, Streptococcus spp. и Clostridium ramosum с интенсивностью 20%, 20%, 15% и 18% соответственно.

При широком спектре микроорганизмов, выявленных в исследуемой пробе, ДНК-чип позволяет определить количественное соотношение содержания выявленных микроорганизмов между собой, что может способствовать внесению коррекции при выборе той или иной схемы терапии.

Рис.2. Соотношение идентифицированных на ДНК-чипе микроорганизмов

Сравнительная характеристика выявленного спектра микроорганизмов с использованием ДНК-чипов и с помощью культурального метода исследования. Спектр микроорганизмов, идентифицированных с помощью ДНК-чипа, отличался от результатов, полученных при стандартном лабораторном обследовании (микроскопия мазка и культуральное исследование) (см. Таблицу №1). Эти различия трудно рассматривать с точки зрения достоверности, так как спектр микроорганизмов, идентифицированных с помощью ДНК-чипа, был обусловлен 42, включенными в него, специфичными для различных микроорганизмов, зондами. бактериальный вагиноз метронидазол

Представители видов микроорганизмов, идентифицированных при использовании рассматриваемых двух методов, различались. Например, с использованием ДНК-чипа было идентифицировано три вида представителей рода Lactobacillus: Lactobacillus fermentus, Lactobacillus brevis и один представитель, не отнесенный к определенному виду, выявленный по положительному результату в зонде, соответствующем Lactobacillus spp. При культуральном исследовании идентифицировались представители рода, без отнесения их к виду.

Таблица №1

Характеристика выявляемых микроорганизмов у пациенток с патологическими выделениями из влагалища с использованием различных методов диагностики (n=45)

С помощью ДНК-чипа с наибольшей частотой выявляли G. vaginalis и A. vaginae: в 30 (66,6%) и 34 (75,5%) случаях, соответственно. При культуральном исследовании G. vaginalis были идентифицированы реже - в 21 (46,6%) случае.

Культуральное исследование на A. vaginae не проводилось ввиду сложности его идентификации при использовании этого метода. В то же время обращало на себя внимание, что на первом месте по частоте обнаружения при культуральном обследовании выявляли не включенные в ДНК-чип микроорганизмы из рода Corynebacterium (в 23 (51,1%) случаях). По данным литературы, филогенетически A. vaginae ближе всего относится как раз к представителям этого рода. Учитывая тот факт, что представители рода Corynebacterium не идентифицировались по видовой принадлежности при культуральном исследовании, можно предположить наличие Atopobium vaginae в структуре положительных ответов на Corynebacterium при стандартном микробиологическом исследовании.

При исследовании на ДНК-чипе представители рода Bacteroides встречались суммарно в 37 (82,2%) случаях, что предопределено тем фактом, что в основной группе 86,7 % составили пациентки с БВ. При стандартном микробиологическом обследовании представители рода Bacteroides не обнаруживались, что связано с трудностями культивирования этих микроорганизмов.

Обращало на себя внимание, что некоторые факультативно-анаэробные бактерии и аэробные при культуральном исследовании встречались с несколько большей частотой, чем при исследовании на ДНК-чипе. Это могло быть обусловлено установленным порогом диагностической чувствительности для этих микроорганизмов на ДНК-чипе, когда положительным считался результат, соответствующий результату «обильный рост» при культуральном исследовании. Более высокая частота обнаружения представителей Mobiluncus spp. при микроскопии мазка, окрашенного по Граму, в сравнении с результатами исследования с помощью ДНК-чипа, кроме установленного порога диагностической чувствительности, могла быть обусловлена, еще и тем, что микроскопия мазка позволяет определить морфотип без видовой идентификации микроорганизма. В то время как идентификация с использованием ДНК-чипа позволяла обнаруживать два вида Mobiluncus curtisii и Mobiluncus mulieris.

В целом спектр микроорганизмов, идентифицированных у пациенток с жалобами на выделения из влагалища с помощью ДНК-чипа, оказался в два раза шире, чем при культуральном исследовании. При этом с помощью ДНК -чипа часто обнаруживались облигатно-анаэробные и микроаэрофильные микроорганизмы, тогда как при культуральном исследовании чаще обнаруживались факультативно-анаэробные и аэробные бактерии.