Институт биохимической технологии и нанотехнологии
Направление нанотехнологии и микросистемная техника
РЕФЕРАТ
ПЦР- АНАЛИЗ. ПРИНЦИПЫ, ПРИМЕНЕНИЕ
Работу выполнила студентка Гомзина О.В.
1 курс, группа ЦНТмд-01-22
Научный руководитель: Доктор химических наук
Профессор Василенко И.А.
Оглавление
Введение
1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
1.1 Метод ПЦР
1.2 Краткая история метода ПЦР
1.3 ПЦР в реальном времени
1.4 Капельные системы
1.5 Системы на базе чипов
2. Примеры обнаружение бактериальных инфекций и микоплазм методом ПЦР
2.1 Обнаружение бактериальных инфекций методом ПЦР
2.2 Обнаружение микоплазмы у женщин методом ПЦР
3. Микрофлюидика и концепции цифровой ПЦР
3.1 Цифровая ПЦР на основе чипов (cd ПЦР)
3.2 Платформы активного разделения
3.3 Платформы пассивного разделения
3.4 Платформы самооцифровки
3.5 Цифровая ПЦР на основе капель (ddПЦР)
4. Перспективы метода ПЦР на будущее
Выводы
Список использованной литературы
Введение
полимеразный цепной реакция инфекция
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) -- это метод молекулярной биологии, используемый для умножения определенных фрагментов дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Это распространенный и незаменимый метод, который применялся во многих областях. Сейчас уже используется третье поколение полимеразной цепной реакции, капельная цифровая полимеразная цепная реакция. Дополнительным преимуществом ПЦР является то, что они обладают реальной чувствительностью 90% -96%, что приводит к снижению доли нелеченных инфекций (ложноотрицательных тестов) по сравнению с методами на основе антигенов [6].
ПЦР стала одним из самых ценных методов, используемых в настоящее время в биологических науках, диагностике и криминалистике. В настоящее время существует две основные области применения ПЦР в биологии науках: системы ПЦР с высокой пропускной способностью и ПЦР-устройства на основе микрофлюидики по месту оказания медицинской помощи (ОМП). Мы также обсудим коммерциализацию этих методов и в заключение рассмотрим их модификации и использование в инновационных областях биомедицины. Например, ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени является золотым стандартом диагностики SARS-CoV-2. Его также можно использовать для приложений ОМП, поскольку он является ключевым компонентом системы «от образца до ответа».
Цель работы - изучить особенности и чувствительность метода ПЦР, принципы действия и основные области применения.
1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
1.1 Метод ПЦР
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это метод, широко используемый в молекулярной биологии для быстрого создания миллионов или миллиардов копий конкретного образца ДНК, позволяющий ученым взять маленький образец ДНК и увеличить его до достаточно большого количества для подробного изучения. С помощью ПЦР копии очень небольших количеств последовательностей ДНК экспоненциально амплифицируются в серии [1, 2].
Термические циклы подвергают реагенты повторяющимся циклам нагревания и охлаждения, чтобы обеспечить различные температурно-зависимые реакции, в частности, разделение ДНК и ферментативную репликацию ДНК (Рисунок 1).
Рисунок 1 Термоциклер для проведения ПЦР
В ПЦР используются два основных реагента - праймеры (которые представляют собой короткие одноцепочечные фрагменты ДНК, известные как олигонуклеотиды, которые являются комплементарной последовательностью к целевой области ДНК) и ДНК-полимераза.
На первом этапе ПЦР две цепи двойной спирали ДНК физически разделяются при высокой температуре в процессе, называемом денатурация нуклеиновой кислоты. На втором этапе температура понижается, и праймеры связываются с комплементарными последовательностями ДНК. Затем две цепи ДНК становятся матрицами для ДНК-полимеразы для ферментативной сборки новой цепи ДНК из свободных нуклеотидов, строительных блоков ДНК. По мере развития ПЦР полученная ДНК сама используется в качестве матрицы для репликации, приводя в движение цепную реакцию, в которой исходная матрица ДНК экспоненциально амплифицируются.
Почти во всех применениях ПЦР используется термостабильная ДНК-полимераза, такая как Taq-полимераза, фермент, первоначально выделенный из термофильной бактерии Thermus aquaticus. Если бы используемая полимераза была термочувствительна, она денатурировалась бы при высоких температурах.
Анализ на основе ДНК-полимеразы стал незаменимым во многих областях (биология, криминалистика, медицина и пр.) [3, 4]. Установленные методы, такие как обычная ПЦР и количественная ПЦР в реальном времени (КПЦР), а также новые, такие как цифровая ПЦР (ДПЦР) и массивно-параллельное секвенирование (MPS), являются ключевыми инструментами для принятия решений, например, в криминалистическом ДНК анализе, безопасности пищевых продуктов, клинической диагностике и пр. [5]. Одна из основных аналитических задач заключается в том, что интересующие образцы часто содержат небольшое количество нуклеиновых кислот в сочетании со сложной матрицей [6]. Молекулы из матрицы образца, клеток-мишеней или реагентов, добавленные во время приготовления образца, которые влияют на полимеризацию ДНК in vitro или сигнал флуоресценции, вместе называются ингибиторами ПЦР. Чтобы преодолеть аналитические ограничения в присутствии ингибиторов ПЦР, полезно понять основные механизмы молекулярного ингибирования (Рисунок 2).
Рисунок 2 Иллюстрация критических подреакций в ПЦР. Ингибиторы ПЦР могут влиять на любую из этих подреакций, то есть нарушать отжиг праймеров, влиять на активность ДНК-полимеразы или ухудшать детекцию флуоресценции (по данным [7])
Сила ПЦР заключается в том, что она обеспечивает амплификацию и обнаружение специфических нуклеотидных последовательностей из одной или нескольких молекул-мишеней. Эффективная полимеризация ДНК in vitro требует высокой активности ДНК-полимеразы, а также благоприятных взаимодействий между нуклеиновыми кислотами (денатурация-мишень и отжиг праймера), что означает, что в них вовлечены как биохимические, так и биофизические процессы.
Измерение флуоресценции является основным средством обнаружения и количественного определения нуклеиновых кислот в анализе на основе ДНК-полимеразы благодаря простоте использования и превосходным пределам обнаружения [7]. Интенсивность флуоресценции также используется для мониторинга генерации ампликона. Часто игнорируемым недостатком флуоресцентного анализа является то, что любое вещество, которое нарушает функцию флуорофора, например, гашением флуоресценции, ухудшит анализ [7]. Серотипы уреаплазмы и их антимикробная восприимчивость у пациентов с бесплодием и инфекциями половых путей.
Метод ПЦР является основным методом получения генов, который базируется на способности ДНК-полимеразы образовывать вторую цепочку ДНК. За последние 100 лет было очень мало изобретений, которые могли бы конкурировать с ПЦР, поскольку она произвела революцию в биологических и генетических исследованиях. Mullis и соавт. заметили, что метод секвенирования по дает слабые сигналы при секвенировании одного гена из-за недостаточной концентрации ДНК [8]. Добавление шага денатурации для разделения каждой молекулы двухцепочечной ДНК на две одноцепочечных ДНК и обратного праймера для определения общей длины ампликона привело к амплификации копий ДНК на две. К сожалению, полимераза разрушалась на каждом этапе денатурации, и ее приходилось добавлять для каждого цикла ПЦР, что делало реализацию метода утомительной; в дальнейшем было найдено решение с помощью автоматизированной системы под названием «Baby Blue» (Рисунок 3, А) [9].
Рисунок 3 Развитие системы ПЦР и ее приложений: (A) Прототип термоциклера для ПЦР, разработанный в 1986 году; (B) ПЦР в космической области. (C) ПЦР во временной области; (D) Использование закрепленных аллель-специфических зондов и меченых праймеров для колориметрического обнаружения мутаций в гене бета талассемии (HBB); (E) Одно из первых применений мультиплексной ПЦР, обнаружение делеций в гене DMD у пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна; (F) Последняя версия мультиплексной ПЦР с флуоресцентно-мечеными праймерами и разделением ампликонов с помощью капиллярного электрофореза в настоящее время используется в рутинной судебно-медицинской экспертизе; (G) Использование ПЦР для амплификации аллелей мульти аллельного мини сателлитного локуса, окрашивание ампликонов серебром в полиакриламидном геле и сравнение их длин с аллельным маркером [9]
1.2 Краткая история метода ПЦР
Первоначально ПЦР была разработана для выявления мутаций в гене бета - Талассемии -- группы наследственных заболеваний кроветворной системы, которые характеризуются нарушением синтеза гемоглобина (HBB), вызывающих серповидно клеточную анемию. Гибридизация радиоактивно меченых олигонуклеотидов и последующий рестрикционный анализ использовались в этом проекте для поиска таких унаследованных мутаций. Поэтому последовательности гена в-глобина были выбраны в качестве первых для ферментативной амплификации [9].
Знания, полученные в ходе этой работы над геном HBB, были использованы при анализе аллелей HLA-DQ2 у пациентов с недиагностированным поражением слизистой оболочки тонкой кишки или положительной серологией целиакии и привели к разработке метода генотипирования этого мульти аллельного локуса с использованием гибридизации ампликонов с аллель-специфичными олиго нуклеотидами [9]. Методика применялась в трансплантологии и криминалистике. Последовали многочисленные клинические применения ПЦР, особенно в области клинической генетики и в микробиологии для выявления вирусных и бактериальных инфекций [10, 11]. Полезность ПЦР как инструмента диагностики инфекционных заболеваний была впервые продемонстрирована при их обнаружении в 1987 г. и получила дальнейшее развитие в последующие годы [9].
Обнаружение того, что ампликоны разной длины, определяемые разными парами праймеров, могут продуцироваться одновременно в одной пробирке для ПЦР, стало важной вехой в развитии методов ПЦР-диагностики. Это так называемая мультиплексная ПЦР, которая использовалась на ранних этапах разработки ПЦР для обнаружения делеций в DMD -- одном из крупнейших генов человека (Рисунок 3, E) [7]. Этот ген локализован на Х-хромосоме, и его мутации ответственны за мышечную дистрофию Дюшенна-Беккера у мужчин. До недавнего времени на этом принципе основывались многочисленные диагностические подходы. В последнее время подготовка библиотек больших генных панелей для секвенирования нового поколения (NGS) также была основана на высоко мультиплексной ПЦР [12].
После публикации пионерского исследования, в котором была продемонстрирована амплификация ДНК из одиночных сперматозоидов [9], началась новая область применения ПЦР. Эта новаторская разработка привела к недавнему широкому использованию ПЦР в криминалистике и вспомогательной репродукции, где требуется анализ генетического материала из одной или нескольких клеток.
ПЦР вошла в область криминалистики, когда исследователи успешно продемонстрировали мультиплексирование шести высоко полиморфных мини сателлитных локусов в одной пробирке для ПЦР. Этот успех был достигнут благодаря высокой воспроизводимости результатов, полученных при использовании нанограммов человеческой ДНК. Дальнейшая разработка этих принципов привела к внедрению мультиплексного микро сателлитного анализа, окрашиванию ампликонов серебром в полиакриламидном геле и сравнению их длин с аллельным маркером - лестницей (Рисунок 3, G) [9]. Затем проводили разделение ампликонов с флуоресцентной меткой методом капиллярного электрофореза. Эта разработка позволила ученым работать с более короткими длинами ампликонов и анализировать сильно разложившийся материал [9]. Эта методология в настоящее время представляет собой основной рабочий процесс в лабораториях судебной экспертизы (Рисунок 3, F) [9].
С 1993 года, после разработки метода мониторинга кинетики ПЦР в реальном времени [13], методы ПЦР стали полностью количественными (кПЦР). Включение обратной транскрипции (ОТ) в качестве первого шага перед термоциклированием позволило использовать технологии ПЦР (ОТ-ПЦР или кОТ-ПЦР) в исследованиях РНК [9]. Эти модификации основного метода ПЦР быстро стали золотым стандартом для количественного анализа нуклеиновых кислот.
1.3 ПЦР в реальном времени
ПЦР в реальном времени основана на ПЦР и измеряет количество продукта ПЦР после каждого раунда амплификации с использованием флуоресцентного считывания [14]. Типичный график амплификации ПЦР в реальном времени представляет собой кривую сигмоидальной формы (в линейном масштабе) и включает базовую фазу, за которой следует экспоненциальная фаза, которая достигает плато через линейную фазу (Рисунок 4). Экспоненциальная фаза представляет собой наиболее эффективную фазу амплификации, и количество продуктов ПЦР удваивается с каждым циклом, если эффективность амплификации составляет 100%.
Рисунок 4 Анализ количественной ПЦР в реальном времени с использованием стандартной кривой; (а) Кривые амплификации для серии 6-точечных 10-кратных разведений матрицы с известными концентрациями (стандарт) более пяти порядков (например, геномная ДНК, ПЦР- ампликон, линеаризованная плазмида); (б) Стандартная кривая создается путем нанесения значений Cq, полученных из кривых амплификации серии разведений, в зависимости от логарифма стандартного количества. Стандартная кривая используется для интерполяции целевого количества. Наклон стандартной кривой измеряет эффективность амплификации количественной ПЦР. Наклон -3,32 (для стандартной кривой, полученной из серии серий 10-кратных разведений) указывает на 100% эффективность амплификации, т. е. количество продукта ПЦР удваивается во время каждого цикла [15]