Выполнение dПЦР с физическими перегородками или камерами включает в себя заполнение устройства, разделение образца, термоциклирование и считывание результатов анализа. Следует отличать активные методы разделения, которые включают либо реконфигурацию устройства, либо механическое срабатывание, от пассивных методов разделения, которые основаны на гидродинамических эффектах или свойствах.
3.2 Платформы активного разделения
Одно из первых микрожидкостных устройств dПЦР основывалось на микрофлюидных клапанах, которые были созданы путем наложения жидкостной и управляющей сетей микрофлюидных каналов, изготовленных из эластомерного материала ПДМС [15]. Эти сети разделены тонкой мембраной, которая может быть деформирована в микрофлюидный канал путем приложения давления к противоположному управляющему каналу, чтобы создать «запирающий» клапан (Рисунок 9, а). Рабочий процесс включает: (1) заполнение всех камер реакцией; (2) давление на контрольный слой, который закрывает соединение между камерами, тем самым изолируя камеры друг от друга. Такое устройство позволило создать разделы размером 14 х112 Ч 6,25 нл.
Рисунок 9 Платформы активного секционирования. (а) Схема нажимного клапана в микрожидкостном чипе из ПДМС. Левая панель: каналы управления (красные) отделены от жидкостных каналов (синие) тонкой гибкой мембраной (желтая); (b) Устройство SlipChip основано на двух половинках чипа, которые содержат массивы открытых камер. Скользящее движение создает массивы независимых микрореакторов
3.3 Платформы пассивного разделения
Пассивное разбиение использует флюидные эффекты для создания подобъемов и не полагается на механические методы. Ключевое отличие от его макромасштабного аналога заключается в том, что микролунки обычно загружаются все сразу, чтобы полностью использовать распараллеливание, предлагаемое форматом. Это, в свою очередь, требует метода, который изолирует микролунки друг от друга и позволяет избежать быстрого испарения мизерных объемов. Чтобы поддерживать эффективное заполнение и разделение микролунок, необходимо иметь различные свойства поверхности между внутренней частью микролунки, которая должна быть гидрофильной, и верхней поверхностью массива (между микролунками), которая должна быть гидрофобной [15].
В отличие от этих активных стратегий, разделение в этом формате можно выполнять пассивно, используя слой несмешивающегося масла после загрузки водной фазы в микролунки. Масляная фаза преимущественно смачивает верхнюю часть массива и создает мениск, вытесняющий водную фазу; тройная линия масловодная фаза - сплошная линия закрепляется на переходах между гидрофобными и гидрофильными областями [15]. Граница раздела жидкость-жидкость простирается от закрепленной тройной линии до тех пор, пока не достигнет другого гидрофобного пятна, где будет создана еще одна распространяющаяся тройная линия.
3.4 Платформы самооцифровки
Платформы самооцифровки сочетают в себе как пассивное заполнение, так и разбиение. Пассивное наполнение может быть реализовано за счет использования эффекта закрепления для эффективного вытеснения воздуха жидкостью во время наполнения. Это было достигнуто за счет расположения двух рядов камер поперек основного канала (Рисунок 10) [15].
Рисунок 10 Самозаполняемые и разделяющие платформы; (а) Геометрия в шахматном порядке, где заполнение контролируется пиннингом. Конструкция обеспечивает эффективное заполнение путем быстрого движения раствора через ловушки и, таким образом, предотвращает захват воздуха внутри камер; (б) Схема устройства самооцифровки, содержащего 1020 лунок. Устройство сначала заполняется маслом, затем заполняется реакционной смесью и впрыскивается еще один поток масла, чтобы создать массив капель
Приведение в действие также может сыграть ключевую роль в упрощении экспериментальной установки. Например, спиннинг может распределять жидкость по камерам, расположенным вдоль спиралевидного канала.
3.5 Цифровая ПЦР на основе капель (ddПЦР)
Образец проходит через микрофлюидный чип, образуя сегментированный поток, в котором образец разделяется на десятки тысяч капель, разделенных несмешивающейся жидкостью, такой как минеральное масло, образующее эмульсию. Эмульсию собирают во флакон, проводят ПЦР, а затем образец обрабатывают на проточном цитометре для подсчета количества капель с положительным результатом ПЦР. Проводят термоциклирование, фиксируют и оценивают флуоресцентное изображение капель. По сравнению с qПЦР, ddПЦР имеет преимущества более высокой точности и более низкого коэффициента вариации при абсолютном количественном определении [9]. Мультиплексирование ПЦР обычно проводят с помощью флуоресценции на основе зондов с разными цветами возбуждения для каждой ДНК/РНК. Он также используется для создания библиотек для секвенирования одноклеточной РНК [9].
Первой целью эмульгирования является создание изолированных микрореакторов из капель воды в несмешивающемся масле. Важнейшим компонентом этой технологии является состав поверхностно-активного вещества и масла, который обеспечивает как стабильность этих микрореакторов, так и их совместимость с молекулярными реакциями, такими как ПЦР или изотермическая амплификация [18].
Инкапсуляция не всегда выполняет разделение образца, и ее можно использовать только для создания независимых микрореакторов, таких как BEAMing (бусины, эмульсия, амплификация, магнетизм) [19]. В этом методе разделение достигается с помощью магнитных шариков, которые захватывают целевые последовательности, путем ограничения разбавления таким образом, чтобы одна молекула захватывалась на шарик. Инкапсуляция выполняется для создания капель с одним шариком, используемых в качестве независимых микрореакторов для амплификации целевой последовательности и насыщения поверхности шарика. Эмульсии можно легко и быстро получить механическим сдвигом, при котором образуются полидисперсные капли. После извлечения шариков связанные с шариками последовательности, помеченные флуоресцентной меткой, идентифицируют с помощью проточной цитометрии с очень высокой пропускной способностью. Магнитные шарики обеспечивают простую и эффективную очистку образцов и манипулирование ими. Этот подход применяется для количественной оценки генетического дисбаланса конкретных генетических локусов [15]. Сила этого метода заключается в преобразовании молекулярного сигнала в цитометрические показания с минимальными ограничениями на процесс эмульгирования.
Методы микрожидкостных капель отличаются от BEAMing использованием капель в качестве настоящих разделов. Они становятся возможными благодаря методам микрожидкостного эмульгирования, которые создают монодисперсные капли с очень ограниченным изменением объема ().
Рисунок 11 Платформы на основе микрожидкостных капель; (а) Схема, иллюстрирующая образование капель с помощью сопла или генератора капель; (б) Сигнал флуоресценции от капель может быть обнаружен последовательно; ( с) Сигнал капель также может быть запрошен с помощью широкоугольного детектора, который позволяет одновременно анализировать до 1 миллиона капель; (d) Микрожидкостные капли могут быть созданы с помощью упрощенной экспериментальной установки, основанной на градиенте удержания (тип ступенчатого эмульгирования); (e) Генераторы капель были приведены в действие центрифугой, что позволяет одновременно инкапсулировать несколько образцов [15]
Применение dПЦР на основе микрожидкостных капель стало возможным благодаря амплификации одиночных молекул. Используя микрофлюидику на основе капель, количество разделов можно регулировать в соответствии с требованиями приложения, например, с устройствами, способными генерировать более 1 миллиона капель. Кроме того, изменение объема микрофлюидных капель находится в пределах нескольких процентов. Производительность образования капель может быть увеличена с помощью систем с несколькими соплами или за счет разделения капель.
Есть два аспекта усилий по коммерциализации, которые сделали ПЦР золотым стандартом в молекулярной диагностике. Одним из них является разработка автоматизированного прибора, заменяющего ручные операции, а другим -- набор реагентов, повышающих специфичность ПЦР, устраняющих перекрестное загрязнение и ингибирование, сокращающих время реакции и повышающих способность к мультиплексированию.
Наиболее значительным успехом миниатюризации и использования микрофлюидики является dПЦР, метод, обеспечиваемый микрофлюидикой. Системы на основе капель и чипов были коммерциализированы с количеством подвыборок (лунок) более 1 миллиона.
4. Перспективы метода ПЦР на будущее
Существует несколько методов, таких как NGS, где ПЦР играет незаменимую роль, и эта роль будет усилена в обозримом будущем. ПЦР будет играть важную роль в будущих методах молекулярной диагностики. Мы можем представить себе использование микрофлюидики для параллельного анализа нескольких образцов с использованием портативных систем. Микрожидкостные устройства также смогут проводить ОТ-ПЦР для анализа иммуномагнитной экзосомальной РНК (Рисунок 12, А) [9]. Количественная ПЦР на основе капель для очистки мРНК одиночных клеток и анализа экспрессии генов станет еще одним крупным применением микрофлюидики в ближайшем будущем (Рисунок 12, B) [9], а также количественные анализы миРНК (Рисунок 12, D) [9] и цифровая ОТ-ПЦР на базе чипа для абсолютного количественного определения мРНК в отдельных клетках (Рисунок 12, В) [9]. В настоящее время параллельное секвенирование всех молекул РНК или ДНК, принадлежащих одной клетке, внутри более крупной клеточной популяции возможно благодаря эмульсионной ПЦР, где нуклеиновые кислоты из каждой клетки заключены в одну каплю, штрих-кодированы и затем амплифицированы [9].
Рисунок 12 Применение микрофлюидики в массово-параллельных и портативных системах оказания медицинской помощи; (A) Интегрированная платформа ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени на основе чипа для анализа иммуномагнитной экзосомальной РНК; (B) Количественная ПЦР на основе капель для очистки одной клетки от мРНК и анализа экспрессии генов; (C) Цифровая ОТ-ПЦР на основе чипа для абсолютного количественного определения мРНК в отдельных клетках; (D) dПЦР на основе капель для количественного анализа мРНК; (E) Система LAMP на бумажной основе, изготовленная из полидиметилсилоксана для молекулярной диагностики; (F) Судебно-медицинская экспертиза, профили ДНК на чипе; (G) BioFire, обнаружение бактерий и вирусов на чипе
Также прогнозируется, что бумажные системы для ПЦР или LAMP будут пользоваться большим спросом для молекулярной диагностики (Рисунок 12, E) [9]. Судебно-медицинская экспертиза будет регулярно проводиться на месте преступления, выполняя профилирование ДНК на чипе (Рисунок 12, F) [9]. Системы обнаружения уже коммерчески доступны, например, BioFire для обнаружения бактерий и вирусов на чипе.
Миниатюризация ПЦР будет продолжаться с разработкой новых систем, объединяющих подготовку образцов с количественной ПЦР, переходя к действительно портативным системам «от образца к ответу» для приложений медицины. Пандемия COVID ускорила эту разработку, вызвав бум систем за счет преобразования существующих устройств на основе LAMP, первоначально разработанного для гриппа, в диагностический инструмент SARS-CoV-2 путем замены праймеров [21, 22]. Можно ожидать дальнейшего развития основанных на CRISPR методов для обнаружения и дифференциации продуктов амплификации, поскольку эта методология успешно применяется в различных областях биологии.
Системы диагностики в конечном итоге могут быть связаны вместе, образуя «интернет вещей», как это было продемонстрировано ранее в ПЦР. Новые системы могут быть автономными или базироваться на смартфоне с операционной системой Android [23, 24]. Преимущество заключается в том, что камерой можно управлять как извне, так и изнутри, и она может обмениваться данными с системой управления температурой и освещением через Bluetooth. После захвата изображения система Android может обработать его и отправить в центр управления по беспроводной сети.
Выводы
ПЦР стала одним из самых ценных методов, используемых в настоящее время в биологических науках, диагностике и криминалистике. В данном реферате рассмотрена история развития ПЦР и технологии, которые произошли от исходного метода ПЦР. Анализ на основе ДНК-полимеразы стал незаменимым во многих социальных функциях. Устоявшиеся методы, такие как обычная ПЦР и количественная ПЦР в реальном времени (кПЦР), а также новые, такие как цифровая ПЦР (dПЦР) и массово-параллельное секвенирование (МПС), являются ключевыми инструментами для принятия решений, например, при судебной экспертизе ДНК- анализа, безопасности пищевых продуктов, клинической диагностики и биозаражениям. В работе рассмотрены модификации методов ПЦР и использование в инновационных областях биомедицины. Например, ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени является золотым стандартом диагностики SARS-CoV-2.
Есть два аспекта усилий по коммерциализации, которые сделали ПЦР золотым стандартом в молекулярной диагностике. Одним из них является разработка автоматизированного прибора, заменяющего ручные операции, а другим -- набор реагентов, повышающих специфичность ПЦР, устраняющих перекрестное загрязнение и ингибирование, сокращающих время реакции и повышающих способность к мультиплексированию.
Наиболее значительным успехом миниатюризации и использования микрофлюидики является dПЦР, метод, обеспечиваемый микрофлюидикой. Системы на основе капель и чипов были коммерциализированы с количеством подвыборок (лунок) более 1 миллиона.
Список использованной литературы
1. Полиданов, М. А. Особенности выполнения диагностического ПЦР-анализа / М. А. Полиданов, И. С. Блохин // Стратегия научно-технологического развития России: проблемы и перспективы реализации. Петрозаводск: Международный центр научного партнерства «Новая Наука», 2020. С. 30-47. EDN SXXGMK.
2. Trieu, T. S. Multiplex polymerase chain reaction (M-ПЦР) for bacterial vaginosis detection/ T. S. Trieu, H.M. Nguyen, T. Nguyen [et al.] //Vietnam Journal of Science, Technology and Engineering. 2019. Т. 61. №. 3. С. 52-56.
3. Калашников, А. Е. ПЦР-диагностика возбудителей болезней сортов картофеля (Solanum tuberosum) / А. Е. Калашников, Я. А. Кабицкая // Известия Кабардино-Балкарского государственного аграрного университета им. В.М. Кокова. 2022. № 2(36). С. 5-14. DOI 10.55196/2411-3492-2022-2-36-5-14. EDN RPBWWS.
4. Характеристика микробиоты рта по данным ПЦР-диагностики у пациентов с пародонтитом перед дентальной имплантацией / Е. В. Глазкова, И. С. Лашко, А. Н. Калинина, А. Ф. Степанов // Современные проблемы науки, технологий, инновационной деятельности: Сборник научных трудов по материалам Международной научно-практической конференции. В 4-х частях, Белгород, 31 августа 2017 года / Под общей редакцией Е. П. Ткачевой. Том Часть II. Белгород: Общество с ограниченной ответственностью "Агентство перспективных научных исследований", 2017. С. 12-16. EDN ZFNBBJ.
5. Николаева, А. Ф. Разработка и характеристика метода многолокусной метилчувствительной ПЦР в режиме реального времени / А. Ф. Николаева, В. О. Сигин, А. И. Калинкин [и др.] // Медицинская генетика. 2022. Т. 21. № 1. С. 34-43. DOI 10.25557/2073-7998.2022.01.34-43. EDN EFZWWK.
6. Hedman, H. ПЦР detection of microbial pathogens, methods in molecular biology/ J. Hedman, P. Radstrom //Methods in Molecular Biology. 2013. Т. 943. С. 17-48.
7. Sidstedt, M. ПЦР inhibition in qПЦР, dПЦР and MPS--mechanisms and solutions/ M. Sidstedt, P. Radstrom, J. Hedman//Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2020. С. 1-15.
8. Mullis, K. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction/ K. Mullis, F. Faloona, S Scharf [et al.] //Biotechnology Series. 1992. С. 17-17.
9. Zhu, H. ПЦР past, present and future/ H. Zhu, H. Zhang, H., Y. Xu [et al.] //BioTechniques. 2020. Т. 69. №. 4. С. 317-325.