ПЦР в реальном времени позволяет проводить количественную оценку мишени относительно калибратора. Метод является количественным (кПЦР) при калибровке стандартной кривой с использованием данных экспоненциальной фазы. «Абсолютное» количество последовательности-мишени в реакции количественной ПЦР измеряется относительно стандартной кривой, полученной из образца с известным количеством или числом копий (Рисунок 4). Этот метод подразумевает, что эффективность амплификации образца и стандартов эквивалентна.
Внедрение микро жидкостных систем привело к разработке совершенно нового семейства устройств, таких как проточная миниатюрная и быстрая ПЦР. Исследователи, занимающиеся микрообработкой кремния, быстро взялись за эту задачу, разработав миниатюрные [9] и портативные устройства для ПЦР, а затем и количественной ПЦР.
1.4 Капельные системы
Существует несколько методов разделения образцов с образованием капель [9]. Капли, включая клетки, загружаются в микрожидкостный канал и переносятся в разные положения внутри чипа, а затем подвергаются ряду процедур, таких как лизис клеток, выделение и очистка ДНК, ПЦР и обнаружение флуоресценции. Капли с выделенной ДНК в небольшом объеме разделяются несмешивающейся жидкостью, такой как минеральное масло, образуя эмульсию. Затем проводят термоциклирование путем нагревания этой эмульсии, и камеры фиксируют последующую флуоресценцию. Эта платформа обычно используется в исследованиях одиночных клеток, часто называемых «ПЦР одиночных клеток».
1.5 Системы на базе чипов
Различные структуры микросхем изготавливаются путем микрообработки с различными лунками или микрожидкостными каналами в таких материалах, как кремний, стекло или полимеры (обычно полидиметилсилоксан или полиметилметакрилат). Образцы загружают либо в лунки, либо в каналы для последующей амплификации ДНК с помощью ПЦР [9]. Миниатюрные системы ПЦР обеспечивают мобильность и экономию времени. Общее время реакции зависит от ряда параметров, таких как размер чипа, объем мастер-микса для ПЦР, теплопроводность субстрата и скорость циклического изменения температуры. Исследователи успешно сократили время реакции и продемонстрировали чрезвычайно быструю ПЦР с 0,4 с/цикл, в результате чего общее время реакции составило менее 15 с [9].
2. Примеры обнаружение бактериальных инфекций и микоплазм методом ПЦР
2.1 Обнаружение бактериальных инфекций методом ПЦР
Анализ ампликонов на основе ПЦР, такой как секвенирование 16S рРНК, является основным инструментом для количественной оценки и изучения микробного состава, динамики и взаимодействий. Однако, учитывая сложность микробных сообществ, становится необходимым значительное количество образцов для анализов, анализирующих факторы, определяющие микробный состав. Общим узким местом в проведении такого рода экспериментов является выделение геномной ДНК (гДНК), которое требует много времени, дорого и часто предвзято в зависимости от типов присутствующих видов. Метод прямой ПЦР является потенциально более простой и точной альтернативой методам выделения гДНК, не требующим промежуточного этапа очистки. В исследовании [16] авторы оценили три варианта прямых методов ПЦР с использованием различных гетерогенных бактериальных культур, включая как грамположительные, так и грамотрицательные виды, стандарты микробного сообщества ZymoBIOMICS и грунтовые воды. Сравнивая методы прямой ПЦР с наборами DNeasy Blood and Tissue Kits для микробных изолятов и наборами DNeasy PowerSoil для микробных сообществ, авторы обнаружили, что конкретный вариант метода прямой ПЦР демонстрирует общую эффективность, сравнимую с эффективностью обычного протокола DNeasy PowerSoil. Авторы также обнаружили, что этот метод показал более высокую эффективность выделения гДНК из грамотрицательных штаммов по сравнению с протоколом DNeasy Blood and Tissue. Прямой метод ПЦР в 1600 раз дешевле ($0. 34 для 96 образцов) и в 10 раз проще (15 минут практического времени для 96 образцов), чем протокол DNeasy PowerSoil. Метод прямой ПЦР также может быть полностью автоматизирован и совместим с образцами небольшого объема, что позволяет масштабировать образцы и повторы, необходимые для поддержки высокопроизводительного крупномасштабного анализа бактериального сообщества [16].
2.2 Обнаружение микоплазмы у женщин методом ПЦР
В работе Amirmozafari N. и соавт. [17] были отобраны 210 пациентов женского пола, которые обратились к врачам для лечения инфекций женских половых путей, у каждого пациента были взяты образцы эндоцервикальных мазков.
Олигонуклеотидные праймеры были выбраны из опубликованных нуклеотидных последовательностей консервативной межгенной спейсерной области в 16S-23S рРНК микоплазм и модифицированы для того, чтобы иметь возможность детектировать все три генитальные микоплазмы одновременно (Таблица 1).
Для проведения ПЦР использовали готовый раствор Master Mix (Ampliqon Co., Дания). Реакционная смесь для ПЦР (общий объем 50 мкл) включала: 15 мл раствора мастер-смеси 1X. ПЦР проводили в системе ПЦР GenAmp (Corbeit, Германия) в соответствии со следующей программой: предварительная денатурация в течение 5 минут при 95 °C с последующими 30 циклами, каждый из которых содержал денатурацию при 94 °C в течение 30 секунд, отжиг при 56 ° C в течение 30 секунд.
Таблица 1
Последовательности олигонуклеотидных праймеров, специфичных для гена 16S-23S рРНК микоплазм
Анализ продукта ПЦР: продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 3% агарозном геле, их визуализировали с последующим окрашиванием зеленым SYBER (Рисунок 5). Для окончательного подтверждения амплифицированные полосы подвергали секвенированию ДНК, а также расщеплению рестрикционной эндонуклеазы M. genitalium и U. urealyticum ферментами.
Рисунок 5 Электрофорез в агарозном геле продуктов амплификации ПЦР, полученных из образцов ДНК пациентов. Дорожки 1 являются отрицательным контролем и не показывают микоплазменную инфекцию. На дорожке 2 показан продукт амплификации в количестве 559 п.н. Urealyticum и 630 п.н. M. hominis. Дорожка 3 показывает 465 п.н. M. genitalium и U. urealyticum. Дорожка 4 показывает M. genitalium и M. hominis. Дорожка 5 показывает M. genitalium, U. urealyticum и M. hominis. Дорожка 6 - маркер размера ДНК (лестница ДНК 100 п.н.) [17]
ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
210 обследованных пациентов имели средний возраст 31,9 года (SD = 9,7). 76,7% никогда не имели беременности, и только 2,9% из них имели роды. У пациенток были влагалищные выделения, крапивница и раздражение вульвы, а вагинит и цервицит были частыми осложнениями (Таблица 2).
Таблица 2
Клинические симптомы и осложнения у женщин с генитальной микоплазменной инфекцией [17]
Результаты ПЦР показали, что 57,1% (120 случаев) пациентов были инфицированы микоплазмой. Уровень изоляции для M. hominis составил 20% (42 случая), M. genitalium - 5,2% (11 случаев) и U. urealyticum - 44,3% (93 случая). Кроме того, 25 образцов были ПЦР-положительными для всех трех организмов, в которых только 21 образец был обнаружен при помощи ПЦР-позитивных признаков, указывающих на коинфекции бактерий M. hominis и U. urealyticum.
Для подтверждения результатов ПЦР амплифицированные продукты ДНК (Рисунок 5) подвергали секвенированию ДНК, а также расщеплению рестрикционной эндонуклеазой (номер доступа для U. urealyticum: GQ375145 и номер доступа для M. genitalium GQ367563). Усиленные полосы, относящиеся к M. genitalium и U. urealyticum, разрезали CaC8I (фрагменты 73 и 393 п.н.) и TaqI (фрагменты 227 и 332 п.н.) соответственно (Рисунок 6, Рисунок 7). Результаты секвенирования ДНК сравнивали с известными последовательностями ДНК гена 16S-23S рРНК каждой микоплазмы, соблюдаемыми в Genbank. Когда последовательности анализировали с помощью программного обеспечения Blast, это четко указывало, что каждый из амплифицированных продуктов действительно принадлежал к соответствующей микоплазме.
Рисунок 6 Паттерны полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP) продуктов ПЦР из Mycoplasma genitalium после расщепления; Дорожка 1: 465 п.н. продуктов ПЦР Mycoplasma genitalium соответственно; Дорожка 2: продукты ПЦР Mycoplasma genitalium после расщепления CaCI соответственно; Дорожка 3: продукты ПЦР Mycoplasma genitalium после расщепления TaqI (не расщепляется); Дорожка 4 - маркер размера ДНК (лестница ДНК 100 п.н.) [17]
Рисунок 7 Паттерны полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP) продуктов ПЦР из Ureaplasma urealyticum после расщепления рестриктазами TaqI; Дорожка 1: продукты ПЦР Ureaplasma urealyticum после расщепления TaqI соответственно; Дорожка 2: продукты ПЦР длиной 559 п.н. Ureaplasma urealyticum соответственно; Дорожка 3: продукты ПЦР Ureaplasma urealyticum после расщепления CaCl (не расщепляется); Дорожка 4 - маркер размера ДНК (лестница ДНК 100 п.н., SM # 333) [17]
Обнаружение Mycoplasma spp. является клинически значимым в свете возросшей способности бактерий прилипать и колонизировать эндоцервикальные выстилки и тем самым вызывать клинические симптомы у женщин, у плода, а также у новорожденных. Поэтому быстрое выделение этих бактерий является клинически важным. Мультиплекс-ПЦР часто проводят с использованием пар праймеров для обнаружения множества различных организмов, обычно по одной паре праймеров для каждого агента. Часто необходимо оптимизировать условия реакции для каждого набора праймеров. Поскольку каждый набор праймеров имеет свою собственную температуру плавления и время отжига, часто очень трудно достичь согласованной температуры и времени отжига, чтобы все пары праймеров могли присоединиться к своим целевым последовательностям.
В этом исследовании частота выделения микоплазмы методом ПЦР составила 57,1%. Кроме того, случаи смешанных инфекций, которые были обнаружены с помощью ПЦР, были значительными (11,9%). Исследование показывает, что высокий процент пациентов действительно был инфицирован U. urealyticum (44,3%) и в меньшей степени M. genitalium (5,2%). Уровень заражения M. hominis составил 20% [17].
3. Микрофлюидика и концепции цифровой ПЦР
Концепция цифровой ПЦР - d ПЦР была разработана [15] с использованием микропробирок или 384-луночных микропланшетов. Микрофлюидика, то есть миниатюризация работы с жидкостями, сделала возможным массивно-параллельное разделение образцов и появление платформ dПЦР. Микрофлюидика опирается на методы микропроизводства, адаптированные из микроэлектроники, и ее реализация зависит либо от быстрого прототипирования с помощью мягкой литографии в полидиметилсилоксане (ПДМС), травления стекла или литья под давлением [15]. Многочисленные активные и пассивные микрожидкостные методы использовались для разделения образцов, от физических перегородок до жидких капель. Большинство этих методов допускают простую автоматизацию и ограниченное использование реагентов.
Многие технологии произошли от оригинальной ПЦР; одним из примеров является цифровая ПЦР - dПЦР [15], которая основана на разделении ПЦР-образца на тысячи, а в некоторых случаях и на миллионы подвыборок из исходной молекул ДНК. После ПЦР доля положительных по амплификации фрагментов используется для количественного определения концентрации целевой последовательности со статистически определенной точностью с использованием статистики Пуассона (Рисунок 8). Интересно, что разделение образцов эффективно концентрирует целевые последовательности в изолированных микрореакторах. Этот эффект концентрации снижает конкуренцию матриц и, таким образом, позволяет обнаруживать редкие мутации. Кроме того, этот метод может также обеспечить высокую толерантность к ингибиторам, присутствующим в образце.
Рисунок 8 Принципы цифровой ПЦР. Образец разделен на множество независимых разделов, каждый из которых содержит либо несколько целевых последовательностей, либо не содержит их вовсе. Распределение целевых последовательностей в разделах можно аппроксимировать распределением Пуассона. Каждый раздел действует как отдельный микрореактор ПЦР, и разделы, содержащие амплифицированные последовательности-мишени, обнаруживаются с помощью флуоресценции. Отношение положительных долей (наличия флуоресценции) к общему количеству позволяет определить концентрацию в образце [15]
Чувствительность сильно зависит от количества ложноположительных и ложноотрицательных событий. Хотя dПЦР является цифровым анализом, обнаруженный сигнал изначально является аналоговым, и необходимо применять порог, чтобы отделить истинный сигнал от фонового сигнала. Ложноположительные результаты могут возникать из-за плохого дизайна анализа или из-за обнаружения ложной амплификации при большом количестве циклов ПЦР. Кроме того, они также могут возникать в результате перекрестного загрязнения во время экспериментальной установки [15].
В то время как ложноположительные результаты могут быть сведены к минимуму за счет надлежащего дизайна и оптимизации анализа [15], ложноотрицательные результаты или молекулярное выпадение менее вероятны. Внутренний дизайн анализов dПЦР делает его склонным к молекулярному выпадению по разным причинам: (1) повышенное отношение поверхности к объему из-за разделения небольшого объема увеличивает вероятность ингибирования ПЦР из-за взаимодействия реагентов с поверхности; (2) было замечено, что амплификация одной молекулы часто менее эффективна, чем амплификация с большим числом молекул; (3) эффективность амплификации сильно зависит от источника ДНК (т. е. геномной или плазмидной, фрагментированной или длинной ДНК), и может быть нарушена при нагревании молекул ДНК [15].
3.1 Цифровая ПЦР на основе чипов (cd ПЦР)
Образец загружается в кремниевые чипы с лунками, выполненными методом микрообработки. Затем проводят термоциклирование и визуализируют чип с помощью флуоресцентной микроскопии [9] для определения количества лунок с положительными результатами ПЦР. Мультиплексирование выполняется так же, как и в dd ПЦР [9]. Микроконструкция на основе кремния позволяет комбинировать cd ПЦР, интегрированный с нагревателем/датчиком, с использованием ионно-чувствительного полевого транзистора в каждой лунке для мониторинга ПЦР, устраняя необходимость в отдельной системе флуоресцентной визуализации.