Материал: Стволовые клетки и молекулярная биология

Молекулярно биологические методы изучения стволовых клеток

В настоящее время для изучения стволовых клеток особое значение приобрели следующие молекулярно биологические методы: интерференция РНК и техника микрочипов, а также метод генных ловушек, протеомный анализ, генетическая трансформация.

Интерференция РНК

Интерференция РНК - это механизм, имеющий место в большинстве эукариотических клеток для избавления от чужеродных двухцепочных молекул РНК. В течение шести лет после первого сообщения об интерференции РНК было продемонстрировано, что она изменяет экспрессию генов в клетках млекопитающих и широкого спектра эукариот, и ее использовали, как средство генетических исследований точно так же, как возможную стратегию генетической коррекции/53/.

Интерференция РНК (RNAi) была признана мощным орудием идентификации функции генов во многих биологических процессах, она может быть использована для широких генетических исследований в клетках млекопитающих. Для этих целей кассеты, которые индуцируют RNAi, могут быть эффективно введены в геном клеток хозяина с использованием вирусных векторных систем, что приводит к подавлению экспрессии генов - мишеней. Временное подавление экспрессии генов может быть также индуцировано экзогенным введением подходящих триггеров RNAi в клетки - мишени/39/. интерференция эукариотический клетка молекула

Интерференция РНК(RNAi), эволюционно крайне консервативный процесс транскрипционного (путем метилирования ДНК) и посттранскрипционного подавления активности гена, может быть запущен малыми интерферирующими РНК(siRNA), которые опосредуют последовательность - специфичную деградацию иРНК. Со времени первого сообщения в 1998 году RNAi быстро развилось в эффективный инструмент для специфичного выключения экспрессии генов у большого разнообразия клеток - мишеней. В соответствии с этим RNAi в настоящее время используется как для систематического функционального анализа генома у некоторых организмов, так и для специфического терапевтического вмешательства в преклинических моделях различных болезней, характеризуемых нарушенной экспрессией генов. Однако поскольку siRNA не реплицируется в клетках млекопитающих в течение процесса интерференции РНК, кинетические аспекты siRNA - индуцированного подавления активности генов, которые, в конечном счете, зависят от внутриклеточного уровня siRNA, должны быть рассмотрены для каждого аналитического или терапевтического приложения в этих клетках/40/.

Интерференция РНК(RNAi) является последовательность - специфичным подавлением активности генов, индуцированным двухцепочечной РНК(dsRNA), которая быстро дает информацию о функции генов.

Использование RNAi для генной терапии широко изучается, в особенности при вирусных инфекциях, опухолях и наследственных генетических заболеваниях. RNAi использовалась для получения мышей c нокдауном для изучения функционирования генов в целом животном. Совместно с данными геномики подавление активности генов с помощью RNAi может способствовать определению функции любого гена, экспрессируемого в клетке.

Термин RNAi появился в связи с открытием, что инъекция dsRNA у Caenorhabditis elegans интерферирует с экспрессией специфических генов, содержащих комплементарную область в введенной dsRNA. У млекопитающих введение длинных dsRNA (длиннее, чем 30 нуклеотидов) вызывает неспецифический интерфероновый ответ, что приводит к приостановлению экспрессии всех генов и гибели клетки. Группа Tom Tuschl обнаружила, что трансфекция синтетической 21 - нуклеотидной двухцепочечной РНК(siRNA) была высоко специфичной и являлась последовательность - специфичным ингибитором эндогенных генов в клетках млекопитающих. Экспрессия РНК, подавляющих транскрипцию, изучалась с помощью РНК из плазмид и вирусных векторов. Они доставляют подавляюшую экспрессию РНК как в делящиеся, так и в неделящиеся клетки, столовые клетки, зиготы и их делящиеся потомство. Коллекция векторов RNAi, которые супрессируют 50 человеческих ферментов позволила Thijn Brumme lkamp с коллегами изучить семейство генов и определить эти энзимы в значимых для опухолей путях ((Nature 2003; 424: 797-801).

Эти исследователи обнаружили, что ген супрессор семейной цилиндроматозной опухоли, функция которого до сих пор была не известна, может способствовать активации фактора транскрипции NF-kappaB, что ведет к увеличению устойчивости к апоптозу. Они начали в настоящее время изучать использование ингибиторов этого гена в клинике. Способность эффективно и стабильно продуцировать и доставлять достаточные количества siRNA в надлежащие ткани-мишени нуждается в совершенствовании перед применением в клинике. Начальные исследования in vivo показали эффективную трансгенную супрессию синтезированными siRNA у взрослых мышей. В более недавнее время многие исследователи использовали плазмидные вирусные векторы для транскрипции коротких шпилечных РНК in vivo и in vitro. В этих системах экспрессии экспрессия генов более стабильно ингибировалась, чем у транзиентных нокдаунов, химически синтезированной siRNA. Должны вскоре последовать исследования на человеке, использующие эти последние открытия/50/ .

Интерференция РНК (RNAi) является последовательность - специфичным подавлением активности генов, индуцированным двухцепочечной РНК. Она представляет собой инструмент избирательного подавления экспрессии генов. Недостатками использования плазмидных ДНК, кодирующих siRNA, являются: `токсичность', низкий уровень трансфекции по сравнению с химически синтезированными siRNA.

Техника микрочипов ДНК

Микрочипы ДНК используются для одновременного определения уровней тысяч иРНК в образце. Коллекция таких измерений в различных клеточных типах и состояниях является надежным источником для функциональных предсказаний при том условии, что microarray эксперименты являются аналогичными, и образцы клеток достаточно разнообразны. Этот подход использовался для изучения стволовых клеток, чья идентичность и механизмы контроля не достаточно хорошо понимаются. Были получены данные Affymetrix microarray из более чем 200 образцов включающие стволовые клетки человека, мыши и их дериваты. С результатами исследования можно ознакомится online (StemBase; http://www.scgp.ca:8080/StemBase/)/31/.

Microarray технология быстро становится стандартной лабораторной техникой. Основные сложности, связанные с успешным применением этой технологии, относятся к анализу. В этой статье дан практически ориентированный обзор, посвященный анализу данных по большому числу генов. Описываются различные обычные методы кластеризации, и дается методика их использования. Обсуждаются методы оценки генов по их значимости на основании статистического анализа Microarray результатов. Рассматривается проблема выяснения биологического смысла результатов microarray экспериментов, и описываются современные инструменты, которые представляют различные, но надежные направления в обеспечении автоматических решений этой проблемы. Инструменты и подходы, представленные в статье, должны дать читателю предварительное понимание анализа результатов microarray экспериментов/20/.

Микрочипы ДНК используются для одновременного определения уровней тысяч иРНК в образце.

Ассиметричное деление стволовых клеток

Стволовые клетки получили особенно большое значение в течение последних лет, поскольку они представляют возможные инструменты для восстановления поврежденных органов. Эти клетки найдены не только в основных регенерирующих тканях, таких, как эпителий и кровь, но также в статических тканях, таких, как нервная система и печень, где они играют центральную роль в тканевом росте и сохранении.

Механизм, с помощью которого стволовые клетки поддерживают популяции высоко дифференцированных короткоживущих клеток, как кажется, включает критический баланс между альтернативными путями (судьбами): дочерние клетки либо сохраняют идентичность стволовых клеток, либо инициируют дифференциацию.

Недавние исследования на низших организмах выявили регуляторный механизм ассимитричных клеточных делений стволовых клеток. В этих моделях окружение, вероятно, обеспечивает ключевые инструктивные сигналы для выбора судьбы клеток. Наше понимание сейчас распространяется на внутренние механизмы клеточной полярности, которая влияет на ассиметричные деления стволовых клеток/12/.

Таким образом, судьба стволовых клеток у низших организмов, т.е. сохранение ими идентичности стволовых клеток или инициация дифференцировки решается в ходе ассимитричного клеточного деления.