Материал: Стволовые клетки и молекулярная биология

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК)

Самообновление ЭСК

Самообновлеие мышиных ЭСК зависит от внешних сигналов: от лейкемического ингибиторного фактора (leukemia inhibitory factor (LIF)) и костного морфогенетического белка (bone morphogenetic protein (BMP)).Эти молекулы активируют, соответственно, перемещение в ядро латентного транскрипционного фактора STAT3 и экспрессию генов Id. Наоборот, белки гомеодомена Oct4 и недавно идентифицированный Nanog являются внутренними факторами, требующимися для поддержания недифференцированного состояния. При избыточной экспрессии Nanog позволяет ЭСК самообновляться в отсутствие в других случаях обязательных LIF и BMP сигналов.

Однако наибольшая эффективность самообновления ЭСК имеет место, когда Nanog оверэкспессируется и клетки подвергаются действию LIF. Когда Oct4 оверэкспрессируется, ЭСК дифференцируются сходным образом при удалении LIF. Эти наблюдения сопоставлены для того, чтобы дать генетическую модель самообновления ЭСК, основанную на взаимодействиях между Oct4, STAT3 and Nanog/6/.

Oct4 и Mango являются внутренними факторами, требующимися для поддержания недифференцированного состояния ЭСК у мышей.

Дифференцировка ЭСК

В нескольких последних работах использовали технику microarray, серийный анализ экспрессии генов (SAGE) и экспрессию свободных концов для получения характеристик транскриптома человеческих эмбриональных стволовых клеток и их дифференцированных производных. С помощью этих подходов получены ценные данные и выявлен факт, что большой процент генов остается не охарактеризованным в этих клетках, представляюших раннее развитие человека/36/.

ЭСК характеризуются своей способностью неограниченно размножаться в культуре, сохраняя нормальный кариотип и недифференцированное состояние. Они обладают потенциалом дифференциации в любой специализированный тип клеток тела. Знание транскрипционного профиля, связанного с плюрипотентностью и ранним развитием, необходимо для лучшего понимания их потенциала развития и поддержания недифференцированного состояния.

В настоящее время существует несколько экспериментальных техник, используемых для определения профиля экспрессии генов в эмбриональных стволовых клетках. В этом обзоре суммирована информация, полученная с использованием техники microarray и других подходов по анализу экспресии генов в стволовых клетках у мыши и у линий человеческих клеток/33/.

ЭСК перспективны для лечения дегенеративных заболеваний человека. Поскольку ЭСК являются плюрипотентными, они могут быть проходить дифференцировку в определенное количество альтернативных клеточных типов с потенциальной терапевтической ценностью. Такие подходы, как “рационально направленная дифференциация ЭСК”, представляют собой попытки повторить аспекты нормального развития in vitro. Все дифференцированные клетки сохраняют идентичное содержание ДНК, хотя экспрессия генов широко варьирует от одного клеточного типа к другому клеточному типу.

Поэтому действенная эпигенетическая система возникла для координации и поддержания типов тканево-специфичной экспрессии генов. Последние достижения показывают, что механизмы, которые управляют эпигенетической регуляцией экспрессии генов, имеют корни в динамике ремоделирования хроматина, а также метилирования ДНК. По мере дифференцировки эмбриональных клеток определенные гены активируются, в то время как активность других подавляется. Эти активирования и события подавления активности тесно скоординированы с локализацией клеточных линий.

Ремоделирование хроматина регулируемых в развитии генов происходит в связи с определением линий. Ооциты, ранние эмбрионы и эмбриональные стволовые клетки содержат действенные хроматин - ремоделирующие активности. Это наблюдение заставляет предположить, что динамика хроматина может быть особенно важной для ранних решений по развитию линий. Динамика хроматина также связана с дифференцирвкой взрослых стволовых клеток. Сборка специлизированого хроматина тканевоспецифичных генов была изучена подробно. Через несколько лет должен быть достигнут ошеломляющий прогресс в понимании дифференциации стволовых клеток и биологии развития в отношении динамики хроматина/34/.

У взрослых млекопитающих имеются сотни клеточных типов, распределенных между органами, причем в каждой клетке содержится идентичное количество ДНК. Тем не менее, каждый из этих клеточных типов имеет уникальный образец экспрессии генов. Эпигенетика занимается влияниями на экспрессию генов, независимо от ДНК последовательности per se. В принципе гены ведут себя тремя способами в течение развития. Некоторые гены активируются в зависимости от клеточной линии, другие претерпевают подавление активности также в зависимости от клеточной линии, например, инактивация Х хромосомы или подавление активности таких эмбриональных генов, как Oct 4.

И, наконец, активность генов “домашнего хозяйства” поддерживается постоянно. Хотя каждая клетка содержит одинаковое количество ДНК, способ ее упаковки с хромосомными белками (т.е. хроматин) существенно различается от клетки к клетке. Действительно, последние открытия в области исследования хроматина и клонирования (пересадка ядер) заставляют предположить, что большая часть молекулярного базиса тканевоспецифичной экспрессии генов связана с деталями структуры хроматина/34/.

Базовой субьединицей хроматина является нуклеосома, которая состоит из гистонового октамера, содержащего по паре стандартных гистонов H2A, H2B, H3 и H4 и 146 пар оснований ДНК. Хроматин может быть разделен на две фракции: эухроматин, который разрешает транскрипцию, и гетерохроматин, который запрещает ее. Гетерохроматин имеет две фракции: конститутивную и факультативную. ДНК в конститутивном гетерохроматине облигатно молчит. Примеры включают центромерные области и инактивированные повторяющиеся элементы, такие, как Alu, LINE и SINE элементы и инактивированные ретровирусы. По контрасту, факультативный хроматин молчит только в определенных контекстах.

Примерами факультативного гетерохроматина являются тканевоспецифичные гены, которые молчат во всех, кроме определенной ткани. Гетерохроматин, по-видимому, имеет значительно большую молекулярную сложность, чем эухроматин. Большая часть эухроматина состоит из стандартных нуклосом, а гетоерохроматин состоит из модифицированных нуклеосом, в которых варианты гистонов замещают стандартные гистоны.

Примеры включают варианты гистона H2A макроH2A1 и макроH2A2 и вариант гистона H3 CENP-A, который ассоциирован с центромерным гетерохроматином, а также гистоны H2A.X and H2A.Z. Гистон H2A.X фосфорилируется, когда ДНК повреждена, и отмечает места двухцепочечных разрывов в ДНК, в то время как H2A.Z защищает эухроматин от перехода в транскрипционно неактивную форму. Хроматин далее модифицируется путем добавления пострансляционых модификаций в гистоны, таких как метил-, ацетил-, фосфорил - и АДФ рибозидная группы.

Модификации гистонов могут служить как cis-действующие связывающие места для вспомогательных факторов, таких как гетерохроматиновый белок 1, который связывается с гистоном H3 за счет метилирования по остатку лизина 9, что является основным биомолекулярным взаимодействием в гетерохроматине и контролируется Suv39h1 и Suv39h2 гистоновой метилтрансферазой. Метилирование гистонов также происходит в гистоне H3 в позиции 4 лизина, но в этом случае метилирование коррелирует с транскрипционной активностью. Сама ДНК может метилироваться в основном по остаткам цитозина в CpG динуклеотидах.

Здесь также метилирование способствует биомолекулярным взаимодействиям между гетрохроматином и вспомогательными белками, такими, как MeCP2, and MBD1, 2 и 3.На молекулярном уровне тесные взаимосвязи существуют между хроматином и транскрипционным аппаратом. Важность транскрипционных факторов для активации генов бесспорна, но известно, что значительная часть транскрипционных факторов взаимодействуют со способствующими транскрипции ацетилтрансферазами. В результате появился взгляд, что модификация гистонов является переключателем для активации или репрессии экспрессии генов, сходно с путем, каким фосфаты переключают активацию или репрессию внутриклеточной сигнальной трансдукции.

По мере того, как ЭСК претерпевают дифференцировку, они спонтанно выполняют регулируемые развитием программы экспрессии и подавления активности генов, которые координируются с изменениями в структуре хроматина. Изучение взрослых стволовых клеток дают свидетельство, что хроматин функционирует в специализированных событиях дифференцировки/34/.

Тотипотентность клеток млекопитающих пленяла воображение ученых в течение поколений. Длительно существовавший вопрос, сохраняют ли некоторые ядра соматических клеток тотипотентнсть, был разрешен клонированием Dolly в конце ХХ столетия. Рассвет ХХ1 века вызвал большие ожидания относительно использования тотипотентности в медицине. Через биологию стволовых клеток возможно создавать любые части человеческого тела путем инжиниринга стволовых клеток. Значительные ресурсы будут использованы для овладения неиспользованными потенциалами стволовых клеток в обозримом будущем, что может трансформировать медицину, какой мы знаем ее сегодня. На молекулярном уровне тотипотентность связана с фактором транскрипции и его экспрессия, по-видимому, определяет будет ли клетка тотипотентной. Oct4 может активировать или репрессировать экспрессию различных генов.

Любопытно, что очень мало известно об Oct4, кроме его способности регулировать экспрессию генов. Механизм, с помощью которого Oct4 определяет тотипотентность, остается полностью не решенным/30/.

Развитие эмбриона млекопитающих контролируется регуляторными генами, некоторые из которых регулируют транскрипцию других генов. Эти регуляторы активируют или репрессируют экспрессию генов, которые опосредуют фенотипические изменения в течение дифференцировки стволовых клеток. Oct4 принадлжит к семейству факторов транскрипции POU. Семейство POU может активировать экспрессию их генов - мишеней путем связывания с октамерной последовательностью AGTCAAAT. Последние данные свидетельствуют, что Oct4 почти полностью экспрессируется только в эмбриональных клетках.

В течение эмбрионального развития, Oct4 экспрессируется в начальной стадии во всех бластомерах. Затем его экспрессия оказывается ограниченной внутренней клеточной массой и снижается в трофектодерме и примитивной эндодерме. В зрелом возрасте, экспрессия Oct4 ограничивается только развивающимися зародышевыми клетками. Прицельное разрушение Oct4 привело к образованию эмбрионов без плюрипотентной клеточной массы, что заставляет предположить, что Oct4 необходим для поддержания плюрипотентности.

Более того, количественный анализ экспрессии Oct4 выявил, что высокий уровень экспрессии Oct4 вызывает развитии эмбриональных клеток по линиям мезодермы и эндодермы; эмбриональные клетки с нормальным уровнем Oct4 остаются плюрипотентными; при низком уровне Oct4 эмбриональные клетки становятся клетками трофектодермы. Таким образом, было предположено, что Oct4 является ключевым регулятором плюрипотентности и дифференцировки стволовых клеток/30/.

Добавляется новая транскрипционная операционная система к известным системам Oct4 and Stat3, требующимся для действенности ранних эмбриональных стволовых клеток и их самообновления. Nanog, транскрипционный фактор, играет критическую роль во второй спецификации судьбы эмбриональных клеток, следующей за формированием бластоцита/5/.

ЭСК получают из внутренней клеточной массы перед имплантацией бластоцитов, они могут само обновляться и дифференцироваться во все клетки и ткани тела. ЭСК являются непревзойденным стартовым материалом критического, большей частью недоступного периода развития, так же, как и важным источником клеток для трансплантации и генной терапии. Несмотря на их потенциал, попытки получить специфические клеточные типы из ЭСК были только частично успешными из-за того, что, большое число комбинаций факторов роста и связанный с развитием контроль генов, участвующих в ограниченной дифференцировке клеточного типа, не известны.