В перспективе предполагается использовать векторы, в которые встроены не только гены, контролирующие синтез протективных антигенов, но и гены, кодирующие различные медиаторы иммунного ответа. Получены рекомбинантные штаммы БЦЖ, которые секретируют ИФ-у, ИЛ, Г-КСФ. Предварительные исследования свидетельствуют о высокой эффективности штаммов в отношении туберкулеза и рака мочевого пузыря. Получать эффективную векторную вакцину на основе бактерий достаточно трудно из-за нестабильности трансфекции генного материала, токсичности чужеродного антигена для бактерий, малого количества экспрессированного антигена.
2. Неживые вакцины
Молекулярные вакцины конструируют на основе специфических протективных антигенов, находящихся в молекулярном виде и полученных путем биосинтеза или химического синтеза. К этим вакцинам можно отнести также анатоксины, которые представляют собой обезвреженные формалином молекулы токсинов, образуемых микробной клеткой (дифтерийный, столбнячный, ботулинический и др.). Корпускулярные вакцины получают из цельных микроорганизмов, инактивированных физическими (тепло, ультрафиолетовое и другие излучения) или химическими (фенол, спирт) методами (корпускулярные, вирусные и бактериальные вакцины), или из субклеточных надмолекулярных антигенных структур, извлеченных из микроорганизмов (субвирионные вакцины, сплит-вакцины, вакцины из сложных антигенных комплексов).
Инактивированные вакцины всегда требуют нескольких вакцинаций. Защитный иммунный ответ развивается обычно только после второй или третьей дозы. Количество антител постепенно снижается, поэтому спустя некоторое время для поддержания титра антител требуется повторная вакцинация (ревакцинация).
Молекулярные антигены, или сложные протективные антигены бактерий и вирусов, используют для получения синтетических и полусинтетических вакцин, представляющих собой комплекс из специфического антигена, полимерного носителя и адъюванта. Из отдельных вакцин (моновакцин), предназначенных для иммунизации против одной инфекции, готовят сложные препараты, состоящие из нескольких моновакцин. Такие ассоциированные вакцины, или поливакцины, поливалентные вакцины, обеспечивают иммунитет одновременно против нескольких инфекций. Примером может служить ассоциированная АКДС-вакцина, в состав которой входят адсорбированные дифтерийный и столбнячный анатоксины и коклюшный корпускулярный антиген. Существует также семейство полианатоксинов: ботулинический пентаанатоксин, противогангренозный тетраанатоксин, дифтерийно-столбнячный дианатоксин. Для профилактики полиомиелита применяют единый поливалентный препарат, состоящий из аттенуированных штаммов I, II, III серотипов (сероваров) вируса полиомиелита [6].
К таким вакцинам относятся корпускулярные бактериальные и вирусные вакцины, корпускулярные субклеточные и субъединичные вакцины, а также молекулярные вакцины. Корпускулярные вакцины представляют собой инактивированные физическими (температура, УФ-лучи, ионизирующее излучение) или химическими (формалин, фенол, р-пропиоактон) способами культуры патогенных или вакцинных штаммов бактерий и вирусов. Инактивацию проводят в оптимальном режиме (инактивирующая доза, температура, концентрация микроорганизмов), чтобы сохранить антигенные свойства микроорганизмов, но лишить их жизнеспособности. Корпускулярные вакцины, полученные из цельных бактерий, называют цельно-клеточными, а из неразрушенных вирионов ? цельновирионными. Инактивированные вакцины готовят в асептических условиях на основе чистых культур микроорганизмов. К готовым, дозированным (по концентрации микроорганизмов) вакцинам добавляют консервант. Вакцины могут быть в жидком (суспензии) или сухом виде. Вакцинацию выполняют 2?3 раза, вводя препарат подкожно, внутримышечно, аэрозольно, иногда перорально. Корпускулярные вакцины применяют для профилактики коклюша, гриппа, гепатита А, герпеса, клещевого энцефалита. К корпускулярным вакцинам относят также субклеточные и субвирионные вакцины, в которых в качестве действующего начала используют антигенные комплексы, выделенные из бактерий или вирусов после их разрушения. Приготовление субклеточных и субвирионных вакцин сложнее, чем цельноклеточных и цельновирионных, однако такие вакцины содержат меньше балластных компонентов микроорганизмов. Раньше субклеточные и субвирионные вакцины называли химическими, поскольку применяли химические методы при выделении антигенов, из которых готовили вакцину. Однако этот термин более применим к вакцинам, полученным методом химического синтеза. В настоящее время используют субклеточные инактивированные вакцины против брюшного тифа (на основе О-, Ни Viантигенов), дизентерии, гриппа (на основе нейраминидазы и гемагглютинина), сибирской? язвы (на основе капсульного антигена) и др. Такие вакцины, как правило, применяют с добавлением адъювантов.
2.1 Синтетические пептидные вакцины
Синтетические пептидные вакцины могут содержать различные эпитопы, способные формировать иммунитет к разным видам инфекций. Отличаются высокой? степенью стандартности, безопасны, однако слабо иммуногенны и требуют применения эффективных адъювантов. Идея использования синтетических пептидов в качестве вакцин родилась при изучении клеточных и молекулярных механизмов развития иммунитета, прежде всего исследования начальных этапов развития иммунитета ? процессинга антигена в вспомогательных клетках и презентации антигена Т-клеткам.
Вирусные и бактерийные пептиды, образующиеся из персистирующих в клетках возбудителей?, взаимодействуют с антигенами гистосовместимости класса I и индуцируют прежде всего цитотоксические CD8 Т-клетки. Экзогенные антигены, попадающие в клетку в составе лизосом, расщепляются до пептидов, которые в комплексе с антигенами гистосовместимости класса II активируют СО4 Т-хелперы.
В 1974 г. М. Села впервые описал искусственно полученный? пептид, вызывающий? образование антител к яичному лизоциму. При определенных условиях синтетические пептиды могут обладать такими же иммуногенными свойствами, как и естественные антигены, выделенные из возбудителей? инфекционных заболеваний.
Для получения хорошего иммунного ответа необходимо, чтобы синтетический? антиген содержал на менее 8 аминокислотных остатков, хотя в структуру антигенной? детерминанты могут входить 3?4 аминокислоты. Минимальный? молекулярный? вес такой? детерминанты составляет около 4000 кД.
Получены многочисленные виды искусственных антигенов: линейные полимеры, состоящие из L-аминокислот, разветвленные многоцепочечные сополимеры, конъюгаты различного рода пептидов с аминокислотами гомополимерами.
Синтезированы и испытаны полисахариды, аналогичные естественным антигенам, например сальмонеллезным полисахаридам. Молекула синтетических вакцин может содержать разнородные эпитопы, которые способны формировать иммунитет к разным видам инфекций.
Экспериментальные синтетические вакцины получены против: дифтерии, холеры, стрептококковой? инфекции, гепатита В, гриппа, ящура, клещевого энцефалита, пневмококковой?, сальмонеллезной инфекций.
Несмотря на значительные успехи в теоретическом обосновании возможности использования синтетических пептидов для создания вакцин, ни один препарат такого типа не зарегистрирован в международной медицинской практике. Однако есть все основания считать, что синтетические пептиды найдут применение в качестве вакцин.
У синтетических пептидов нет недостатков, характерных для живых вакцин (реверсия патогенных свойств, остаточная вирулентность, неполная инактивация и т.п.). Синтетические вакцины отличаются высокой степенью стандартности, обладают слабой реактогенностью, они безопасны, с помощью таких вакцин можно избежать развития аутоиммунных процессов при иммунизации, а при использовании доминантных пептидов можно получить вакцины против возбудителей с высокой степенью изменчивости.
ВОЗ одобрила рекомендации по разработке и контролю синтетических пептидных вакцин (1997). Прежде всего должен быть детально отработан метод искусственного синтеза выбранных пептидов и получены доказательства устойчивости такого синтеза. Должны быть идентифицированы отдельные пептиды, определены модифицирующие гликозильные, липидные и другие группировки, охарактеризованы примеси, которые могут быть при синтезе пептидного мономера, описаны методы его очистки. Все контрольные измерения необходимо производить с использованием референс-препаратов. Следует определить лимиты конечной концентрации всех добавок (консерванты, стабилизаторы и пр.). Консерванты не добавляются в препараты, расфасованные по одной дозе.
Синтетические пептиды обладают слабой иммуногенностью. Для их стабилизации, доставки к иммунокомпетентным клеткам и стимуляции иммунного ответа необходим носитель или какой-либо другой адъювант (иммуностимулирующий комплекс, микросферы, липосомы и пр.). Носитель не только помогает пептиду, он способен индуцировать ответ на себя, но не должен доминировать над ответом к пептиду и нарушать его специфичность. Необходимо изучить, на какие иммунокомпетентные клетки действует конъюгат пептида с носителем.
На стадии конъюгирования пептида с носителем надо следить за постоянством весовых соотношений пептида с носителем, которые не должны колебаться от серии к серии. Носитель должен иметь собственную спецификацию по характеристике его биологических свойств и структуры, включая молекулярные параметры.
При использовании других адъювантов следует описать способ взаимодействия пептида с адъювантом и изучить процесс десорбции пептида с адъюванта в течение срока годности препарата.
Конъюгирование и полимеризация, необходимые для получения вакцин, не должны вызывать побочных реакций у экспериментных животных и человека. Образующиеся антитела должны быть проверены на перекрестные реакции с антигенами из различных тканей человека.
Все химические и биологические реагенты, используемые в процессе получения вакцины, должны удовлетворять требованиям международной или национальной фармакопеи. Доклиническая фаза изучения пептидных вакцин должна включать биологические, биохимические, иммунологические, токсикологические, гистопатологические исследования, испытания разных доз и схем введения препарата, получение доказательств его стабильности и безвредности. В рамках рутинного контроля определяются пирогенность, стерильность, иммуногенность и другие параметры безопасности и активности вакцин.
2.2 ДНК-вакцины
ДНК-вакцины ? вакцины из плазмидных ДНК, кодирующих протективные антигены возбудителей инфекционных заболеваний. Такая ДНК при введении в организм проникает в ядро клетки, длительное время существует вне хромосом без репликации, транскрибируется и экспрессирует соответствующие антигены, вызывающие в организме формирование Tи B-клеточного иммунитета.
Идея использовать фрагменты ДНК для вакцинации появилась в 1950?60-е гг. После серии опытов было установлено, что генетическая информация ДНК сохраняет способность транскрибироваться и транслироваться после переноса в другую клетку. В том же году обнаружили, что введение животным генома вируса полиомиелита стимулирует выработку антител. Позже активацию гуморального иммунитета показали для молекул ДНК, полученных из неинфекционных агентов. Начиная с 1990-х гг. научные лаборатории начали все активнее исследовать иммуностимулирующие свойства ДНК. В 1992 г. Танг вместе с коллегами показал, что ген гормона роста человека, встроенный в плазмиду, стабильно экспрессируется в организме мыши, а синтезированный гормон распознается иммунной системой как антиген и стимулирует выработку антител. Процесс ввода плазмидной ДНК для стимуляции гуморального иммунитета был назван Тангом «генетическая иммунизациия». Однако уже в следующем году другая группа ученых заявила, что введение плазмиды, кодирующей белки вируса гриппа, вызывает как гуморальный, так и клеточный ответ. Индуцирование обеих ветвей иммунитета в том же году обнаружили и для плазмиды, содержавшей гены ВИЧ. С 1995 г. начали появляться данные, что ДНК-вакцинация способна активировать иммунную систему против раковых заболеваний. Около 20 лет назад состоялись первые клинические испытания ДНК-вакцин, которые прежде всего должны были продемонстрировать безопасность нового метода. Пациентам вводили гены ВИЧ, вируса гриппа, герпеса, гепатита B, возбудителя малярии. Результаты всех тестов оказались вполне обнадеживающими: ДНК-вакцины стабильно экспрессировались, провоцировали иммунный ответ и не вызвали серьезных побочных эффектов, что стало толчком для их дальнейшего исследования.
Конструирование ДНК-вакцины. Структура ДНК-вакцины создана на основе плазмидного вектора, ориджин (с англ. origin) - точка начала репликации.
По структуре ДНК-вакцина - это встроенная в вектор нуклеотидная последовательность, кодирующая определенный антиген или антигены. Вектором в генной инженерии называют молекулу нуклеиновой кислоты, которая служит для доставки генетического материала в клетки и обеспечивает его репликацию или экспрессию. Ранее для транспортировки генов в клетку применяли векторы на основе вирусов: модифицированного (ослабленного) вируса натуральной оспы, аденовирусов и ретровирусов. Вирусные векторы являются достаточно эффективными, однако имеют значительную вероятность развития побочных эффектов, связанную с относительно высокой иммуногенностью самого вектора. Поэтому на сегодня в качестве вектора чаще используют бактериальную плазмиду - небольшую стабильную кольцевую молекулу ДНК, способную к автономной репликации. Сама по себе плазмида не вызывает нужного специфического иммунного ответа, для этого в нее вшивают гены иммуногенных белков. Также ДНК-вакцина должна содержать регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии генов в клетках эукариот. Готовую ДНК-конструкцию доставляют в бактериальную клетку, где наращивается количество ее копий. После этого проводят выделение и очистку плазмид, которые несут нужную вставку.
Дизайн плазмидного вектора. Важным этапом создания ДНКвакцин является дизайн (конструирование) вектора. Обязательными структурами плазмидного вектора являются сайты рестрикции, селективный маркер и точка начала репликации ДНК-вакцины в бактериальной клетке. Чтобы осуществлялся синтез антигена, ДНК-вакцина должна содержать промотор и сигнал полиаденилирования. Промотор является важным фактором эффективности вакцины, поскольку определяет силу иммунного ответа: чем больше экспрессия гена, кодирующего вирусный или опухолевый антиген, тем сильнее иммунный ответ. Чаще всего используют промотор вируса SV40 или цитомегаловируса (CMV). Для стабилизации мРНК-транскриптов в плазмиду встраивают сигнал полиаденилирования, чаще всего полученный из гена гормона роста быка (BGH) или вируса SV40. В качестве селективных маркеров выбирают бактериальные гены устойчивости к антибиотикам; часто это ген устойчивости к канамицину. При конструировании ДНК-вакцин наиболее популярна точка начала репликации Escherichia coli.
Выбор гена для иммунизации. Вектор является важным компонентом ДНК-вакцины, однако ее иммуногенность определяется именно вставкой - последовательностью ДНК, которая кодирует антиген. Среди вирусных антигенов для иммунизации лучше всего подходят белки слияния - это относительно консервативные белки, которые обеспечивают проникновение вируса в клетку. Для вакцинации против граммположительных бактерий в плазмидный вектор целесообразно встраивать гены тех бактериальных белков, которые определяют патогенез заболевания. Среди белков грамотрицательных бактерий высокую иммуногенность имеют порины. Для терапевтических противоопухолевых ДНК-вакцин используют белки-маркеры раковых клеток.