5
ФГАОУ ВО «Волгоградский государственный университет»
Факультет естественных наук
Кафедра биоинженерии и биоинформатики
КУРСОВАЯ РАБОТА
по биохимии
Влияние солей металлов и наночастиц серебра на жизнеспособность Paramecium caudatum
Свиридова Ирина Андреевна
Научный руководитель:
к.б.н., доцент
Срослова Г.А.
Нормоконтролер:
к.б.н., доцент
Срослова Г.А.
Волгоград 2016
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность. В настоящее время существует проблема загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами. В отличие от органических загрязнителей тяжелые металлы не подвергаются биодеструкции, аккумулируются как в живых организмах, так и в субстратах. Угнетающее действие тяжелых металлов на все уровни сообществ замедляет процессы самоочистки, а в случае значительного загрязнения тяжелыми металлами снижается видовое разнообразие, что уменьшает устойчивость экосистем.
Поступление тяжелых металлов в окружающую среду связано с активной деятельностью человека. Их основные источники -- промышленность, автотранспорт, котельные, мусоросжигающие установки и сельскохозяйственное производство. К отраслям промышленности, загрязняющим окружающую среду тяжелыми металлами, относятся черная и цветная металлургия, добыча твердого и жидкого топлива, горно-обогатительные комплексы, стекольное, керамическое, электротехническое производство и др. В сельскохозяйственном производстве загрязнение почвы тяжелыми металлами связано с использованием удобрений и пестицидов.
Также угрозу экологии представляет развитие нанопромышленности. Влияние наночастиц на окружающую среду остается неизвестным, в основном из-за отсутствия научных знаний относительно возможного вреда для здоровья человека и экологических рисков, связанных с наноматериалами.
Наибольшее значение для установления баланса в окружающей среде имеют гидробионты, к которым относятся одноклеточные эукариотические организмы Paramecium caudatum (инфузория-туфелька, парамеция хвостатая). Они распространены в гидросфере и имеют ряд преимуществ в качестве тест-организмов. Инфузории являются одноклеточными эукариотами, относящимися к консументам первого порядка. Они широко распространены во всех средах обитания, что делает их подходящей моделью организма для наблюдения влияния физических и химических факторов на биологические сообщества. Более того, они быстро реагируют на токсичные и нетоксичные химические вещества, что обуславливается малым временем генерации и тонкой клеточной мембраной без внешней клеточной стенки.
Степень изученности проблемы. На данный момент проблема оценки токсичности тяжелых металлов освещена во многих работах отечественных и зарубежных авторов. Однако существует небольшое количество работ, посвященных определению токсичности тяжелых металлов на P. caudatum, так как большинство исследований проводилось на бактериях, растениях и многоклеточных животных. Также в настоящее время известна единственная работа, посвященная определению воздействия наночастиц на P. caudatum, принадлежащая авторам из университета Палацкого [13].
Объект исследования - тест - организм Paramecium caudatum.
Предмет исследования - биологическая активность солей тяжелых металлов и серебряных наночастиц, полученных методом химического восстановления.
Цель работы заключается в оценке токсического эффекта, вызываемого тяжелыми металлами и серебряными наночастицами на P. caudatum.
Задачи исследования:
1. Определение токсического эффекта солей тяжелых металлов на P. caudatum.
2. Определение токсического эффекта наночастиц серебра на P. caudatum.
Методологические основы исследования. Исследование носит экспериментальный характер. В ходе работы был разработан и оптимизирован рабочий протокол, позволяющий оценивать токсичность химических соединений и материалов по отношению к P. caudatum. Анализ применим практически к любым химическим соединениям (органические и неорганические вещества, гидрофильные и липофильные соединения), а также к наночастицам. Все эксперименты были выполнены на базе биохимической лаборатории Волгоградского государственного университета.
металл серебро наночастица токсичность инфузория
ГЛАВА 1. Теоретические основы исследования
1.1 Paramecium caudatum как тест-организм
Наиболее типичной моделью для оценки загрязнения природных вод выступают простейшие животные, в частности инфузории-туфельки. P. caudatum относится к классу Ресничных инфузорий. Это наиболее сложно устроенные простейшие, очень чувствительные к изменениям химического состава среды.
Парамеции могут быть легко культивируемы в лабораторных условиях, что делает их идеальным модельным организмом, хорошо подходящим для биологического исследования [17].
Средой обитания инфузории туфельки являются пресные водоемы со стоячей водой и наличием в воде разлагающихся органических веществ. Размеры парамеции хвостатой -- 0,2-0,3 мм. Форма тела напоминает подошву туфли. Пелликула (наружный плотный слой цитоплазмы) включает находящиеся под наружной мембраной плоские мембранные цистерны, альвеолы, микротрубочки и другие элементы цитоскелета [2].
Органами движения парамеций служат реснички (10-15 тыс.), расположенные на поверхности клетки продольными рядами. Трихоцисты - мелкие веретеновидные тельца, расположенные между ресничками, являются органоидами защиты. По стенкам ротовой впадины, или перистома, расположены реснички, собранные в две группы. Они загоняют в глотку вместе с потоком воды основную пищу инфузорий -- бактерии. Наряду с бактериями они могут заглатывать и любые другие взвешенные в воде частицы независимо от их питательности. Мелкие пищевые частицы проникают через рот в небольшую трубковидную глотку и попадают в фагосому, в которой подвергаются перевариванию. Непереваренные остатки пищи выбрасываются наружу в задней части тела через цитопиг, или порошицу. Парамеции дышат всей поверхностью клетки. Продукты азотистого обмена выводятся через поверхность клетки и частично через сократительную вакуоль. Излишки воды выводятся из клетки за счет работы сократительных вакуолей, выполняющих осморегуляторную функцию [8].
Инфузории имеют два рода ядер: большое эллипсоидальное ядро называется макронуклеус, регулирующее клеточный метаболизм и одно маленькое ядро - микронуклеус, участвующее в половом процессе.
Макронуклеусы богаты ДНК и обладают высокой плоидностью в отличие от диплоидного микронуклеуса. В макронуклеусах происходит синтез РНК. ДНК макронуклеуса способна и к репликации. В микронуклеусах же происходит лишь репликация ДНК перед делением, а синтез РНК не осуществляется.
У инфузории-туфельки есть бесполое и половое размножение. При бесполом размножении ядра делятся на две части, и в каждой новой инфузории оказывается по одному большому и по одному малому ядру. Каждая из двух дочерних получает часть органоидов, а другие образуются заново.
При недостатке пищи или изменении температуры инфузории переходят к половому размножению, а затем могут превратиться в цисту.
При половом процессе увеличения числа особей не происходит. Две инфузории временно соединяются друг с другом. На месте соприкосновения оболочка растворяется, и между животными образуется соединительный мостик. Большое ядро каждой инфузории исчезает. Малое ядро дважды делится. В каждой инфузории образуются четыре дочерних ядра. Три из них разрушаются, а четвёртое снова делится. В результате в каждой остаётся по два ядра. По цитоплазматическому мостику происходит обмен ядрами, и там сливается с оставшимся ядром. Вновь образовавшиеся ядра формируют большое и малое ядра, и инфузории расходятся. Такой половой процесс называется конъюгацией. Он длится около 12 часов. Половой процесс ведёт к обновлению, обмену между особями и перераспределению наследственного (генетического) материала, что увеличивает жизнестойкость организмов. (Рис.1)
Рис.1. Конъюгация P. caudatum
1. Соединение двух инфузорий (конъюгантов) друг с другом перистомальными областями с образованием в месте контакта цитоплазматического мостика, соединяющего обе инфузории.
2. Первое деление микронуклеуса.
3, 4. Второе деление микронуклеусов.
5. Дегенерация 3-х ядер из 4-х, деление оставшихся ядер.
6. Обмен мигрирующими ядрами, стационарные ядра остаются в клетке.
7. Слияние (оплодотворение) мигрирующих и стационарных ядер, образование синкариона, расхождение особей.
8. Деление синкариона.
9. Превращение одного из двух ядер, образовавшихся в результате деления синкариона, в макронуклеус, другого - в микронуклеус.
10. Окончание реконструкции ядерного аппарата.
Основные преимущества применения данного тест - организма:
1. Культивировать этих простейших легко, они удобны в использовании, эффективны при ограниченном времени.
2. Характерная особенность инфузорий -- относительно быстрая изменчивость, которая позволяет им адаптироваться к самым разным условиям. Они приспосабливаются и к разному минеральному и органическому составу среды, а также к присутствию растворенных газов. Paramecium caudatum может жить как в аэробных, так и в анаэробных условиях.
3. В биотестах на инфузориях проще всего фиксировать изменение подвижности, гибель и скорость размножения.
4. Инфузории, как и человек, - эукариотические организмы, поэтому их реакция на токсиканты может быть сопоставлена с реакцией человека.
5. С помощью инфузорий возможна оценка токсичности не только водорастворимых соединений, но и соединений, растворимых в ряде органических растворителей;
6. Короткий жизненный цикл и скорость размножения инфузорий позволяют проследить их реакцию на воздействие токсиканта в ряду поколений.
Методологические подходы в исследованиях с использованием инфузорий многообразны и зависят от целей и задач в каждом конкретном случае. В фармацевтических, медицинских, биологических и экологических исследованиях наиболее распространены методы микроскопирования, их применяют в 90% методик. Как правило, это различные модификации подсчета клеток под микроскопом. В ряде случаев фиксируют функциональные и структурные изменения как наиболее быстрые реакции инфузорий. Данный прием удобен для установления концентраций веществ, вызывающих остановку движения ресничек или полный распад (лизис) клетки. Важнейшее преимущество использования простейших в качестве тест-объектов - большое сходство их токсико-биологической реакции с этой реакцией высших животных. Принцип подобного отображения элементарных свойств сравнительно простого живого организма в более высокоорганизованном с постепенным усложнением этих свойств известен как принцип биологического эпиморфизма. Различные организмы эпиморфно проектируются друг на друга. Например, цианид калия прерывает перенос электрона в дыхательной цепи почти у всех организмов, образующих иерархическую лестницу эволюции: от одноклеточного организма до человека.
1.2 Обзор статей, посвященных токсическому действию металлов на инфузорий
На данный момент множество исследований посвящены изучению влияния металлов на животные и растительные клетки, но тонкие механизмы их токсичности до сих пор не раскрыты [5, 14]. Характерная реакция организмов на воздействие тяжелых металлов на клеточном уровне - синтез коротких пептидов-металлотионинов. Такой ответ характерен как для позвоночных, так и беспозвоночных животных, включая инфузорий. Это позволяет говорить о неспецефичности ответа. В состав металлотионинов входит аминокислота цистеин, которая благодаря своему строению проявляет высокое сродство к ионам металлов. При достижении определенных концентраций ионы металлов нарушают структуру и функционирование ферментных систем [10].
| 134126 |
| 1444 |
| 1532 |
| 1804 |
| 1sma5-0at3rev1 |
| 2 Общ фарм + |
| 2270 |
| 2409 |
| 2737 |
| 3 (лекция) Метод нейтрализации |