Курсовая работа: Влияние солей металлов и наночастиц серебра на жизнеспособность Paramecium caudatum

В работе Z. L. Gong с соавторами [11] было исследовано действие Zn²⁺, Cd²⁺, Hg²⁺ на протяжении 24 часов на парамеций. Авторы, основываясь на результатах исследования, выявили, что Cd²⁺ - наименее токсичный, Zn²⁺ -более токсичный и Hg²⁺ - самая токсичная. Смертность парамеций имеет тесную связь с концентрацией ионов, но реакция парамеций на различные сочетания тяжелых металлов требует дальнейших исследований.

В статье ?Physiological responses of Tetrahymena pyriformis to copper, zinc, cycloheximide and Triton X-100? [16] изучены физиологические реакции тетрахимен, являющиеся ответом на действие меди, цинка, циклогексимида и тритона Х-100 (нейтральное ПАВ) в течение 48 часов. В ходе эксперимента выяснилось, что цинк более токсичен, чем медь, но это объясняется связыванием или хелатированием меди до органических соединений, тем самым уменьшается концентрация ионной меди. Тритон Х-100 убивал тетрахимен, нарушая целостность клеточной мембраны. Циклогексимид тормозил рост и размножение инфузорий, но не являлся причиной клеточной гибели.

В статье ученых из Японии [20] рассмотрено влияние никеля на парамеций. Ионы никеля пагубно влияют на микротрубочки ресничек инфузорий, что, в свою очередь, вызывает нарушения в движении ресничек.

В работе Васина Е. А с соавторами [1] исследована токсичность солей Co, Cr, Cu, Cd, Hg, Ni, Pb, Sr в виде нитратов для парамеций. Sr оказался нетоксичен для инфузорий. Оставшиеся металлы разделились на две группы: токсичные Co и Pb и высокотоксичные Cu, Hg, Cd, Ni, Cr.

В работе ?Antibacterial activity and toxicity of silver - nanosilver versus ionic silver? [12] изучена токсичность ионного серебра и серебряных наночастиц по отношению к парамециям. Ионное серебро проявляло токсическое действие, но наночастицы серебра проявляли слаботоксические свойства.

Результаты изученных статей показывают, что наиболее токсичными являются металлы, которые не имеют биологического значения и не имеют широкого распространения в природе, менее токсичные - соли биофильных металлов. Исключение представляет Cu: несмотря на то, что медь - элемент биофильный, она оказывает токсический эффект на клетки. Предположительно, данное явление объясняется высокой проницаемостью клеточной мембраны инфузорий для ионов меди.

1.3 Биологическая активность наночастиц

Биологическая активность наночастиц может быть связана с тем, что размер частиц определяет их способность легко проникать внутрь клеток из внешней среды и распределяться внутри различных тканей и органов. Один и тот же вид наночастиц может по-разному влиять на различные организмы. Например, токсичность серебряных наночастиц против одноклеточных эукариотических организмов P. caudatum значительно ниже, чем токсичность против ранее протестированных бактериальных штаммов. Дисперсия наночастиц серебра, приготовленная с помощью того же процесса восстановления, эффективно убивает бактериальные штаммы с концентрацией серебра, примерно в 3-10 раз меньше [13].

Некоторые наночастицы могут подвергаться биодеградации, при этом изменяется их биологическая и химическая активность. Другие наночастицы не претерпевают изменений и накапливаются в живых организмах. В обоих случаях возникает угроза токсического воздействия наночастиц на экосистемы. Кроме того, было установлено, что на токсические свойства металлических наночастиц помимо размера и формы, влияют кэпирующие реагенты, входящие в состав поверхностной оболочки, а также способ модификации их поверхности [13].

Наночастицы могут представлять опасность для здоровья, и степень ее пока неизвестна. Также неизвестен уровень опасности для потребителей нанопродукции и окружающей среды [9]. Поэтому оценка экологической токсичности получаемых и используемых наночастиц является чрезвычайно важным направлением [7]. Сфера таких исследований находит свое отражение в появлении государственных программ, направленных на разработку системы технических регламентов и других нормативных документов организационно-правового обеспечения безопасности и страхования рисков в области нанотехнологий [3].

Наноматериалы обладают высокой химической и биологической активностью, и поэтому способны образовывать комплексные соединения с ранее неизвестными свойствами. Это обстоятельство увеличивает технологическую перспективность нанообъектов и в то же время заставляет с особым вниманием относиться к возможным экологическим рискам.

ГЛАВА 2. Материалы и методы

2.1 Список использованных материалов и оборудования

В работе были использованы следующие материалы: хлорид натрия NaCl (Россия), хлорид калия (Россия), гидрокарбонат натрия NaHCO₃ (Россия), магния сульфат MgCO₄ (Россия), хлорид кальция (II) CaCl₂ (Россия), нитрат серебра AgNO₃ (Россия), сульфат меди (II) СuSO₄ (Россия), бихромат калия K₂Cr₂O₇ (Россия), Цинк сернокислый 7-водный ZnSO₄?7H₂O (Россия), висмут азотнокислый 5-водный Bi(NO₃)₃?5H₂O (Россия), галлотанин (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Германия), галловая кислота (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Германия), натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный Na₂HPO₄?12H₂O (Россия), дрожжи хлебопекарные сухие «Саф-Момент» (ООО «САФ-НЕВА», Россия).

При выполнении работы были использованы следующие виды лабораторного и аналитического оборудования: автоматические дозаторы фиксированного и переменного объема производства «Ленпипет» (Россия), климатостат Энерголаб (ЗАО «Спецкомплектресурс - 2001», Россия), Термостат CH-100 («BioSan», Латвия), Спектрофотометр SmartSpec Plus («Bio Rad», США), центрифуга лабораторная Scanspeed mini (Дания), микроскоп МИКМЕД 5 LED (Россия), весы лабораторные электронные Discovery (Ohaus corporation, США). В ходе планирования экспериментов и для накопления, хранения и обработки экспериментальных данных были использованы следующие пакеты программ и программные продукты: Word и Excel из пакета Office 2010 («Microsoft», США).

2.2 Культивирование модельного организма

В рамках исследования эксперименты проводились с использованием культуры P. caudatum. Культура содержалась в оптимальном температурном режиме, с освещенностью «день-ночь» (12/12). Перед проведением эксперимента культура отмывалась. Кормление происходило 2 раза в неделю.

Культура парамеций хранится в климатостате при температуре 24-26?C, в режиме обычной освещенности, в стеклянных химических стаканах на среде Лозина-Лозинского.

В качестве корма используются дрожжи хлебопекарные сухие «Саф-Момент» навеска которых (0,07 г) растворяется в 10 мл дистиллированной воды. Кормление инфузорий происходит 2 раза в неделю.

Концентрат среды Лозина-Лозинского готовится следующим образом: в дистиллированной воде растворяют (г) NaCl - 0,1; KCl - 0,01; NaHCO₃ - 0,02; MgSO₄ - 0,01; CaCl - 0,01. Для приготовления рабочего раствора среды производится десятикратное разведение дистиллированной водой исходного концентрата.

Через каждые 1-2 недели культуру инфузорий требуется отмывать от остатков корма и продуктов метаболизма. Для этого культуру инфузорий переливают в узкогорлую колбу, которую накрывают темной тканью, оставляя открытым горлышко. Средой Лозина-Лозинского доводят до верха. Через некоторое время инфузории выплывают в верхнюю часть колбы, после чего их отбирают дозатором на 10 мл и переносят в чистый стакан, а затем снова доливают средой Лозина-Лозинского. Процедура повторяется до тех пор, пока культура не станет прозрачной. После отмывки инфузорий необходимо покормить, а на стакан с ними поставить дату.

2.3 Приготовление растворов реагентов

Приготовление раствора, содержащего 1 мМ Ag⁺. Для приготовления ионного серебра взяли навеску AgNO₃ массой 0,033974 г и разбавили с 200 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 25 мкМ Ag⁺.Взяли 100 мкл раствора, содержащего 1 мМ Ag⁺, смешали с 3,9 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 0,625 мкМ Ag⁺. Взяли 100 мкл раствора, содержащего 25 мкМ Ag⁺, смешали с 3,9 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 1 мМ Cu²⁺.Навеску CuSO₄ массой 0,025 г растворили в 100 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 25 мкМ Cu²⁺. Взяли 100 мкл раствора, содержащего 1 мМ Cu²⁺, смешали с 3,9 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 0,625 мкМ Cu²⁺. Взяли 100 мкл раствора, содержащего 25 мкМ Cu²⁺, смешали с 3,9 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 1 мМ K⁺. Навеску K₂Cr₂O₇ массой 0,0294 г растворили в 100 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 25 мкМ K⁺. Взяли 100 мкл раствора, содержащего 1 мМ K⁺, смешали с 3,9 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 0,625 мкМ K⁺. Взяли 100 мкл раствора, содержащего 25 мкМ K⁺, смешали с 3,9 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 1 мМ Zn²⁺. Навеску ZnSO₄?7H₂O массой 0,0288 г разбавили с 100 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 25 кмМ Zn²⁺. Взяли 100 мкл раствора, содержащего 1 мМ Zn⁺, смешали с 3,9 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 0,625 мкМ Zn²⁺. Взяли 100 мкл раствора, содержащего 25 мкМ Zn⁺, смешали с 3,9 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 1 мМ Bi³⁺. Навеску Bi(NO₃)₃?5H₂O массой 0,0485 растворили в 100 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 25 мкМ Bi³⁺. Взяли 100 мкл раствора, содержащего 1 мМ Bi³⁺, смешали с 3,9 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора, содержащего 0,625 мкМ Bi³⁺. Взяли 100 мкл раствора, содержащего 25 мкМ Bi³⁺, смешали с 3,9 мл дистиллированной воды.

Приготовление 1 мМ раствора галлотанина (ГТ). Навеску Na₂HPO₄?12H₂O массой 2 г полностью растворили в 80 мл дистиллированной воды. Довели до объема 100 мл в мерном цилиндре. Навеску галлотанина массой 0,170 г полностью растворили в 100 мл приготовленного 2% раствора Na₂HPO₄?12H₂O.

Приготовление 8,3 мМ раствора галловой кислоты (ГК). Навеску Na2HPO4?12H2O массой 2 г полностью растворили в 80 мл дистиллированной воды. Довели до объема 100 мл в мерном цилиндре. Навеску галловой кислоты массой 0,1412 г полностью растворили в 100 мл приготовленного 2% раствора Na₂HPO₄?12H₂O.

2.4 Синтез серебряных наночастиц

Метод приготовления наночастиц был основан на химическом восстановлении солей одновалентного серебра в водных растворах [4;17].

В качестве восстановителей использовали галлотанин [18] (рис.2), галловую кислоту [15] (рис. 3).

Рис.2. Галлотанин

Рис.3. Галловая кислота

Таблица 1 Соотношение реагентов для приготовления серебряных наночастиц

Протокол фракционирования наночастиц

1. В 4 микропробирки эппендорф добавили раствор соли серебра и проинкубировали 10 минут в термостате при 37 єС.

2. Добавили остальные реагенты по таблице.

3. Инкубировали в течение 30 минут при температуре 37 °С.

4. Полученные суспензии серебряных наночастиц центрифугировали 15 минут на скорости вращения 1200 об/мин.

5. Перенесли надосадочные жидкости в новые пробирки и подписали (1/7, 2/7, 3/7 и 4/7 соответственно).

6. Пробирки 1/7, 2/7, 3/7 и 4/7 центрифугировали 15 минут на скорости вращения 7000 об/мин.

7. Перенесли надосадочные жидкости в новые пробирки (1/13, 2/13, 3/13 и 4/13).

8. В пробирки с осадком (1/7, 2/7, 3/7 и 4/7) добавили по 1 мл дистиллированной воды в каждую и аккуратно суспендировали до полного исчезновения видимого осадка. Получили образцы для исследования.