Курсовая работа: Влияние солей металлов и наночастиц серебра на жизнеспособность Paramecium caudatum

9. Надосадочную жидкость в пробирках 1/13, 2/13, 3/13 и 4/13 центрифугировали 20 минут на скорости вращения 13500 об/мин.

10. Надосадочную жидкость из пробирок 1/13, 2/13, 3/13 и 4/13 аккуратно (не затронув осадок) отобрали и выбросили.

11. В каждую пробирку 1/13, 2/13, 3/13 и 4/13 добавили по 1 мл дистиллированной воды и аккуратно суспендировали до полного исчезновения видимого осадка. Получили образцы для исследования.

12. Для дальнейшей работы из пробирок 1/7, 3/7, 1/13 и 3/13 взяли по 200 мкл суспензии в новые пробирки (подписали также, но со звездочкой, например 1/7*) и смешали с 400 мкл дистиллированной воды. Таким образом, мы примерно выравниваем концентрацию серебра с разбавленными образцами (2 и 4).

13. Получили для работы 8 образцов - 1/7*, 2/7, 3/7*, 4/7, 1/13*, 2/13, 3/13* и 4/13.

2.5 Определение токсичности химических соединений и наночастиц по отношению к P. caudatum

В ходе работы был разработан и оптимизирован рабочий протокол, позволяющий оценивать токсичность химических соединений и материалов по отношению к P. caudatum. Анализ применим практически к любым химическим соединениям (органические и неорганические вещества, гидрофильные и липофильные соединения), а также к наночастицам. Метод отличается низкой стоимостью, не требует каких-либо специальных или дорогостоящих приборов и инструментов и может быть воспроизведен в любой минимально оборудованной лаборатории. Для оценки токсического воздействия использовали два различных показателя: подвижность инфузорий и их гибель. Анализ может быть адаптирован для оценки как острого, так и хронического (до нескольких суток) воздействия проверяемых соединений/наночастиц.

Протокол оценки токсичности химических соединений и наночастиц по отношению к P. caudatum

1. Эксперимент проводили в лунках планшеты. В лунки дозатором добавляли 1,5 мл среды Лозина-Лозинского, затем с помощью микропипетки помещали инфузорий по 10 штук в каждую лунку.

2. С помощью дозатора добавляли исследуемое вещество в различных концентрациях, для этого было сформировано 6 рядов с четырехкратной повторностью. (Таблица 2)

Таблица 2

3. Планшеты помещались в климатостат на 2 часа, при температуре 25 єС, световом облучении 1200-2500 люкс.

4. Критерием токсичности служила неподвижность или гибель инфузорий. Подсчет клеток проводился с помощью бинокулярного микроскопа МИКМЕД-5 (увеличение 40).

ГЛАВА 3. Результаты исследования

3.1 Оценка жизнеспособности инфузорий P. caudatum при воздействии растворов солей металлов

В результате контрольного опыта, при котором в лунки планшета помещали по 10 клеток инфузорий, после чего инкубировали в течение 24 часов, в некоторых лунках количество инфузорий превысило первоначальные значения. Это объясняется тем, что парамеции при стандартных условиях культивирования делятся 1-2 раза в сутки.

Для определения подвижности инфузорий провели эксперимент, в результате которого установили количество подвижных и неподвижных клеток после добавления различных концентраций токсикантов.

Результаты экспериментов показывают, что чувствительность инфузорий P.caudatum к солям Cu²⁺ лежит в диапазоне от 0,0125 до 1 мкМ. При концентрации 1 мкм соли данного металла все инфузории были неподвижны. Ионное серебро оказалось менее токсичным, чем медь. Чувствительность P.caudatum к солям Ag⁺ начала проявляться при концентрации 0,1 мкМ, однако 100% неподвижность инфузорий наблюдалась при концентрации 0,2 мкМ.

Чувствительность парамеций к солям Zn²⁺ и Bi³⁺ начала проявляться при концентрации 8 мкМ, однако при воздействии солями цинка 100% неподвижность инфузорий наблюдалась при концентрации 20 мкМ, а при воздействии солями висмута - 40 мкМ.

При воздействии на инфузорий раствором соли K⁺ изменений в их жизнеспособности не наблюдалось. Это может быть связано с процессами биохимической адаптации в клетке, связанной с низкой скоростью инактивации ферментов, что также объясняет устойчивость инфузорий к действию Bi и Zn.

Сравнение токсичности исследуемых солей представлено на рисунке 4.

Рис.4. Сравнение токсичности исследуемых солей: А) при концентрации 0,1 мкМ; Б) при концентрации 8 мкМ.

Для более точной оценки токсичности при помощи программы Very Simple IC₅₀ Tool Kit была рассчитана полуингибирующая концентрация для подвижности инфузорий (EC₅₀) для солей, проявивших токсичные свойства (Таблица 3).

Таблица 3 Сводная таблица значений EC₅₀ для солей металлов

Исходя из полученных результатов, исследуемые металлы были расположены в порядке убывания их токсического воздействия на P. caudatum: Cu²⁺ > Ag⁺ > Zn²⁺> Bi³⁺.

3.2 Оценка жизнеспособности инфузорий P. caudatum при воздействии наночастиц серебра

Токсичность наночастиц серебра определяли тем же методом, что и токсичность металлов.

Образцы наночастиц, полученные с использованием в качестве восстановителя галловой кислоты 3/7*, 3/13*, не проявили токсичных свойств по отношению к парамециям на всем концентрационном ряду от 2 мкМ до 40 мкМ.

Чувствительность инфузорий к образцам наночастиц, восстановленных галлотанином (1/7*, 2/7) и галловой кислотой (4/7), и фракционированных на скорости 7000 об/мин лежит в диапазоне от 4 мкМ до 40 мкМ.

Чувствительность инфузорий к образцам наночастиц, восстановленных галлотанином (1/13*, 2/13) и галловой кислотой (4/13), и фракционированных на скорости 13500 об/мин лежит в диапазоне от 8 мкМ до 40 мкМ.

При помощи программы Very Simple IC50 Tool Kit была рассчитана полуингибирующая концентрация для подвижности инфузорий (EC₅₀) для образцов наночастиц, проявивших токсичные свойства. (Таблица 4)

Таблица 4 Сводная таблица значений EC₅₀ для наночастиц серебра

Сравнение токсичности образцов наночастиц представлено на рисунке 5.

Рис.5. Сравнение токсичности образцов наночастиц: А) при концентрации 4 мкМ; Б) при концентрации 20 мкМ

С помощью спектрофотометра SmartSpec^TM Plus ("Bio-Rad", США) в диапазоне длин волн 340-700 нм были получены спектры серебряных наночастиц восстановленных галлотанином. (рис.6,7)

Рис.6. Спектры поглощения наночастиц, восстановленных галлотанином, осажденных на скорости 7000 об/мин.: А) образец 1/7*;Б) образец 2/7; В) образец 4/7.

Рис.7. Спектры поглощения наночастиц, восстановленных галлотанином, осажденных на скорости 13500 об/мин.: А) образец 1/13*; Б) образец 2/13; В) образец 4/13.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На данный момент диапазоны чувствительности инфузорий к токсичному действию тяжелых металлов исследованы явно недостаточно. Имеющиеся по этому вопросу работы немногочисленны, а полученные в них результаты трудно сравнимы между собой из-за разных методик проведения наблюдений и использования разных критериев токсичности.

В настоящей работе был разработан рабочий протокол теста на экотоксичность, доступный для рутинного использования практически в любой лаборатории и характеризующийся низкой стоимостью анализа в сочетании с улучшенной воспроизводимостью и робастностью.

В результате исследования был получен ряд токсичности металлов для инфузорий, соответствующий литературным данным. Такое распределение металлов в ряду токсичности можно объяснить специфичностью их действия на биохимические процессы в организме инфузорий. Однако в клетке возможны процессы биохимической адаптации, связанной с низкой скоростью инактивации ферментов, что объясняет устойчивость инфузорий к действию Bi и Zn.

Также был проведен сравнительный анализ токсичности Ag⁺ (в форме нитрата) и серебряных наночастиц (AgNPs), полученных методом химического восстановления солей одновалентного серебра в водных растворах. Растворы, содержащие Ag⁺ обладали относительно высокой токсичностью по отношению к P. caudatum. Полученные серебряные наночастицы обладали низкой токсичностью по отношению к P. caudatum в сравнении с раствором ионного серебра; часть полученных наночастиц была полностью нетоксична для P. caudatum в примененных экспериментальных условиях.

Список литературы

1.Васин, Е.А. Токсичность солей некоторых тяжелых металлов для инфузорий Paramecium caudatum в краткосрочном эксперименте /Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2009. - №1(4). - С. 804-807.

2.Класс инфузории (Infusoria, или Ciliata) // Мир животных от 24.05.16. - режим доступа: http://animalkingdom.su/books/item/f00/s00/z0000048/st017.shtml

3.Контроль наноматериалов в пищевой продукции Методические рекомендации // Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации от 24.05.16. - режим доступа: http://meganorm.ru/Data2/1/4293798/4293798756.htm

4.Крутяков, Ю.А. Синтез и свойства наночастиц серебра: достижения и перспективы / А.А. Кудринский, А.Ю. Оленин, Г.В. Лисичкин // Успехи химии. - 2008. - №3. - С. 242-269.

5.Мартин, Р. Бионеорганическая химия токсичных ионов металлов// Некоторые вопросы токсичности ионов металлов: Пер. с англ. / Под редакцией Х.Зигеля, А. Зигель. М.: Мир, 1993. - С. 25-61.

6.Методические указания по диагностике алиментарных токсикозов у рыб // Экология производства от 24.05.16. - режим доступа: http://www.ecoindustry.ru/ndocs/view/1205.html

7.Трифонова, Т. А., Экологическая безопасность наночастиц, наноматериалов и нанотехнологий : учеб. пособие / Т. А. Трифонова, Л. А. Ширкин; Владим. гос. ун-т. - Владимир: Изд-во Владим. гос. ун-та, 2009. - С. 64.

8.Шарова, И.Х. Зоология беспозвоночных. М.: ВЛАДОС, 2002. - С. 591.

9.Atiyeh, B. S. Effect of silver on burn wound infection control and healing: Review of the literature // Burns. - 2007. -№33. - P. 139-148.

10. Eriksen K.D.H Cytosolic binding of Cd, Zn, and Ni in four polychaete species /Comp. Biochem. Physiol. - 1990. - V. 95. - № 1. - P. 111-115.

11.Gong Z. Toxicity of Three Heavy Metal Pollutants of the Pharmaceutical Wastewater to Paramecium Caudatum / Advanced Materials Research. - 2014. -Vol. 937, P. 571-577.

12.Kvitek L. Antibacterial activity and toxicity of silver - nanosilver versus ionic silver / A. Panacek, R. Prucek, J. Soukupova, M. Vanickova, M. Kolar, R. Zboril// Journal of Physics. - 2011. - Vol. 304. - №1. - P. 820-829.

13.Kvitek, L. Initial Study on the Toxicity of Silver Nanoparticles (NPs) against Paramecium caudatum / M.Vanickova, A. Panacek, J. Soukupova // Phys. Chem. - 2009. - №113. - P. 4296-4300.

14. Lars, J. Hazards of heavy metal contamination /British Medical Bulletin. 2003. - V. 68. № 1. - P. 167-182.

15.Martэnez-Castanon, G. A. Synthesis and antibacterial activity of silver nanoparticles with different sizes // Nanopart Res. - 2008. - №10. - P. 1343-1348.

16. Nicolau A. Physiological responses of Tetrahymena pyriformis to copper, zinc, cycloheximide and Triton X-100 /Mota M., Lima N. // FEMS Microbiology Ecology. - 1999. - № 30 (3). - Р. 209-216.

17. Paramecium. Protozoan genus //Encyclopaedia Britannica от 24.05.16. - Режим доступа: http://www.britannica.com/science/Paramecium

18.Shrivastava, S. R Characterization of Antiplatelet Properties of Silver Nanoparticles // ACS Nano. - 2009. - №3. - P. 1357-1364.

19.Sivaraman, S. K. A green protocol for room temperature synthesis of silver nanoparticles in seconds / I. Elango, S. Kumar, V. Santhanam // Current Scince . - 2009. - №10. - P. 1055-1059.

Takenaka Y. Identification of Two Nickel Ion-Induced Genes, NCI16 and PcGST1, in Paramecium caudatum /Eukaryot Cell. - 2014. - P. 1181-1190.