137
ческой активности. Это свойство позволяет рассматривать фукоиданы как потенциальное средство для рассасывания тромбов. Дальнейшие исследования показали, что нативный фукоидан из этого вида водоросли увеличивал активность плазминогена invitro, а дополительно сульфатированный фукоидан - ингибировал или не оказывал влияния на этот процесс (Lang et al., 2004; Hall et al., 2006).
Таким образом, сульфатированные полисахариды из бурых водорослей, сочетающие в себе свойства антикоагулянтов, ингибиторов тромбина, фибринолитиков, перспективны для клинического использования и представляют альтернативу гепарину. Приведенные данные свидетельствуют о том, что фукоиданы обладают разносторонней фармакологической активностью и с успехом могут быть использованы для создания новых БАД к пище и лекарственных препаратов.
Наши исследования касались механизмов антикоагулянтного действия фукоиданов, выделенных из бурых водорослей Охотского моря Е evanescensи S. cichorioidesв тестах invitroи invivo(Кузнецова и др., 2003; Дрозд и др., 2006).
При изучении влияния фукоиданов из F. evanescens(I) и S. cichorioides(II) на показатели свертывания крови (нормальной плазмы здоровых доноров) в базовых коагуляционных тестах invitroвыявлено дозозависимое увеличение времени свертывания по показателям АПТВ- ТВ- и ПВ-тестов.
Пролонгирование показателей АПТВ- и ПВ- тестов свидетельствует об эффективном влиянии фукоиданов I и II на механизмы внутреннего и в меньшей степени — внешнего — путей свертывания. Значительное удлинение ТВ, характеризующего конечный этап свертывания или превращение фибриногена в фибрин под воздействием тромбина, свидетельствует о влиянии фукоиданов на этот процесс и предполагает воздействие на тромбин.
В связи с этим нами исследована ингибиторная активность фукоиданов по отношению к тромбину (фактору Па) и к фактору Ха. В частности, проведен анализ специфических антикоагулянтных активностей фукоиданов: удельной антитромбиновой (alia) активности и удельной активности против фактора Ха (аХа). Способность антикоагулянтных препаратов к торможению активности фактора Па (тромбина) и активности Ха является их важной характеристикой, особенно в отношении средств, применяемых для профилактики тромбообразования.
При исследовании invitroбыли установлены следующие показатели ин-гибиторной активности фукоиданов по отношению к тромбину (фактору Па): от 22±7 до 29±6 ЕД/мг для фукоидана из
Е evanescens(I) и от 43±8 до 49±8 ЕД/мг для фукоидана из S. cichorioides(II), по отношению к активи-
138
рованному фактору X (Ха): от 28±7 до 66±10 ЕД/мг для I и от 31±8 до 83±7 ЕД/мг для П. Отношение aXa/alla составило 1,3—2,3 для I и 0,7—1,7 для II, что является показателем терапевтического эффекта и свидетельствует о перспективности практического применения исследуемых фукоиданов в качестве антикоагулянтных и антитромботических средств.
Дальнейшее исследование механизмов антикоагулянтного действия фукоиданов, а именно изучение возможности прямого антитромбино-вого действия фукоидана из F. evanescensили способности тормозить самосборку фибрин - мономера проводили путем оценки его влияния на свертывание очищенного препарата фибриногена тромбином. При анализе полученных нами результатов установлено отсутствие антикоагулянтного эффекта под влиянием фукоидана в диапазоне концентраций от 1 до 1000 мкг/мл, что характерно и для внесения в такую тест-систему гепарина. Это позволило нам предположить, что прямым антитромби-новым действием фукоидан не обладает, а его антикоагулянтное действие обусловлено активацией AT III, т.е., как и гепарин, фукоидан не является прямым ингибитором тромбина, а действует опосредованно, через какой-либо компонент плазмы.
Для проверки данного предположения было предпринято исследование антикоагулянтного действия фукоидана в присутствии AT III и без него с использованием тест-системы с хромогенным субстратом, специфичным по отношению к тромбину.
Результаты данного исследования показывают, что оптическая плотность в смеси фукоидана в концентрации 100 или 1000 мкг/мл, тромбина и хромогенного субстрата, не содержащей AT III, близка к оптической плотности в контроле, где вместо фукоидана вносили буферный раствор. Близкие к контролю значения оптической плотности были обнаружены в смеси тромбина, хромогенного субстрата и гепарина. Т.е., показатели поглощения в пробах под влиянием фукоидана и гепарина являются сопоставимыми. Это свидетельствует об отсутствии самостоятельного (без AT III) антикоагулянтного действия фукоидана. Снижение оптической плотности (в сравнении с контролем) смеси фукоидана в концентрациях 100 или 1000 мкг/мл, тромбина, хромогенного субстрата и AT III было сопоставимым с таким же снижением в смеси гепарина, тромбина, хромогенного субстрата и AT III, различия между этими показателями не являются статистически значимыми (р>0,05). Очевидно, что это снижение обусловлено инактивацией тромбина антикоагулянтом (фукоиданом либо гепарином) в присутствии AT III.
При исследовании антикоагулянтной активности фукоиданов invivoустановлено, что однократное внутрибрюшинное введение фукоидана I
139
в дозе 5 мг/кг мышам линии BALB/c приводило к гипокоагуляции, о чем свидетельствует увеличение времени свертывания в АПТВ-тесте в 3,3 раза (р>0,05) и в тромбо-тесте — в 4,0 раза (р>0,05) через 15 мин после инъекции (табл. 1). По истечении 30 мин время свертывания в этих тестах отличалось от контрольного в 1,8 и 1,6 раза, а через 60 мин показатели коагулограммы возвращались к контрольному уровню. При введении мышам фукоидана II в такой же дозе время свертывания плазмы через 15 мин после введения увеличивалось по сравнению с контролем в 4,1 раза в АПТВ-тесте (р<0,05) и в 5,3 раза в тромбо-тесте (р<0,05); через 30 мин после инъекции препарата время свертывания возрастало в 2,9 и 2,1 раза (р<0,05) соответственно. К контрольному уровню время свертывания возвращалось только через 180 мин, т.е. антикоагулянтный эффект фукоидана II был более продолжителен по сравнению с фукоиданом I (табл. 6.1).
При увеличении кратности введения фукоидана из F. evanescensживотным до 10 (ежедневное внутрибрюшинное введение в течение 10 суток) отмечен более выраженный процесс гипокоагуляции с замедлением по сравнению с контролем времени свертывания в АПТВ-тесте в 3,6 раза, в ПВ-тесте в 3,3 раза, в ТВ-тесте в 7,1 раза (р<0,05) (табл. 2).
В связи с тем, что фукоиданы перспективны для разработки новых БАД к пище и лекарственных препаратов, важным является исследование антикоагулянтной активности фукоиданов при условии их введения per os. В этом случае доза фукоидана составила 50 мг/кг.
При 10-кратном пероральном введении фукоидана показатели гемостаза не отличались статистически значимо от таковых в контроле. При увеличении продолжительности перорального введения фукоидана животным до 30 дней наблюдалось пролонгирование времени свертывания в 1,4-1,5 раза по сравнению с контролем (р<0,05) (табл. 2).
Таким образом, фукоидан из F. evanescensоказывает антикоагулянтный эффект при парентеральном и длительном (30-кратном) пероральном введении животным. С увеличением кратности введения фукоидана развивается более глубокая гипокоагуляция.
140
Таблица 6.1 Показатели гемостаза при внутрибрюшинном введении фукоиданов,выделенных из F. evanescens(I) и S. cichorioid.es(II),
мышам BALB/c
Время после
введения
(мин)
|
Время свертывания плазмы крови (сек)
|
АПТВ
|
ТВ
|
|
I
|
ИС
|
II
|
ИС
|
I
|
ИС
|
II
|
ИС
|
15 ркК pI-II
|
150±20* <0,05 >0,05
|
3,3
|
180±8* <0,05
|
4,0
|
70±10,7* <0,05 >0,05
|
4,1
|
90±14* <0,05
|
5,3
|
30 ркК pI-II
|
90+11
>0,05 >0,05
|
1,8
|
130+11*
<0,05
|
2,9
|
28±3,4 >0,05 >0,05
|
1,6
|
35±2,7* <0,05
|
2,1
|
60 ркК pI-II
|
47±0,9 >0,05 >0,05
|
1,0
|
75±9,7 >0,05
|
1,6
|
17±0,8 >0,05 >0,05
|
1,0
|
20±1,6 >0,05
|
1,2
|
180 ркК pI-II
|
45±1,6 >0,05 >0,05
|
0,99
|
44±1,4
|
0,96
|
17,0±0,9 >0,05 >0,05
|
1,0
|
17±0,8
|
1,0
|
Контроль(К)
|
45,5±1,1
|
17,0±0,5
|
Примечание: показатели гемостаза Ме±т; ИС — индекс стимуляции — рассчитан как отношение времени свертывания в опыте и контроле; р-значимость различий показателей в опыте по сравнению с контролем (К); использован непараметрический Q-критерий Данна; при сравнении показателей I и II использован непараметрический z-критерий Манна-Уитни; п=5; (*р<0,05) — различия статистически значимы по отношению к контролю.
Таблица 6.2
Влияние фукоидана из F. evanescensна систему гемостаза у мышейBALB/c в зависимости от кратности и способа введения
Показатель
гемостаза
(М±т)
|
Группа животных
|
Контроль
|
Фукоидан
1-кратно
в/б
|
ИС
|
Фукоидан
10-кратно
в/б
|
ИС
|
Фукоидан
10-кратно
п/о
|
ИС
|
Фукоидан
30-кратно
п/о
|
ИС
|
АПТВ (сек.) Р
|
45,0±1,2
|
82,0±3,6*
|
1,8
|
163,0±4,8*
|
3,6
|
52,0±2,6
|
1,2
|
62,0±2,6*
|
1,4
|
<0,05
|
|
<0,05
|
|
>0,05
|
|
<0,05
|
|
ПВ (сек.) Р
|
17,0±0,8
|
21,0±1,1*
|
1,2
|
56,0±2,0*
|
3,3
|
20,0±1,4
|
1,2
|
25,0±1,1*
|
1,5
|
<0,05
|
|
<0,05
|
|
>0,05
|
|
<0,05
|
|
141
ТВ (сек.) Р
|
19,0±0,7
|
32,0±1,6*
|
1,7
|
135±4,0*
|
7,1
|
23,0±1,3
|
1,2
|
26,0±1,0*
|
1,4
|
<0,05
|
|
<0,05
|
|
>0,05
|
|
<0,05
|
|