Материал: Аутентичного материала

Примечание: показатели гемостаза Ме±т; ИС — индекс стимуляции — рассчитан как отношение времени свертывания в опыте и контроле; р-значимость различий показателей в опыте по сравнению с контролем; использован непараметрический Q-критерий Данна; п=5; (*р<0,05) — различия статистически значимы.

Для исследования специфической антикоагулянтной активности плазмы в экспериментах invivoфукоиданы I и II вводили однократно внутривенно в дозах 5 и 10 мг/кг крысам Wistar.

При введении фукоидана I отмечено незначительное увеличение показателей антикоагулянтной активности плазмы с увеличением дозы. Так, активность фактора Ха регистрировалась только через 5 мин после введения и составила 0,2±0,02 ЕД/мл и 0,3±0,02 ЕД/мл в зависимости от вводимой дозы. Показатели alia активности через 5 мин после введения фукоидана I составляли достаточную для терапевтического эффекта величину (2,3±0,23 ЕД/мл и 2,5±0,36 ЕД/мл) (табл. 6.3). В отношении фукоидана II в дозе 10 мг/кг аХа доходила до 0,95±0,0б ЕД/мл, a alia до 3,1 ±0,24 ЕД/мл. Эффект по аХа активности для фукоидана II сохранялся до 60 мин (0,43±0,09 ЕД/мл; р=0,002). Длительность эффекта по alia активности составила 180 мин (срок наблюдения) для обоих препаратов. В зависимости от срока после введения крысам каждого из исследуемых препаратов отмечалось снижение эффекта 3—12 — кратно (табл. 6.3).

Таким образом, внутривенное введение крысам фукоиданов I и II вызывает дозозависимое усиление специфической антикоагулянтной активности плазмы. Следует отметить, что, несмотря на больший показатель соотношения aXa/alla для фукоидана I из F. evanescens, сила и длительность антикоагулянтного эффекта для фукоидана II из S. cichorioidesвыше. Это, по-видимому, объясняется различием в удельной антитромбиновой активности образцов (у II фукоидана alia активность в два раза больше, чем у I) при практически одинаковых ингибиторных активностях фукоиданов по отношению к фактору Ха.

Наши исследования включали также изучение способности фукоиданов к комплексообразованию с протамина сульфатом. Необходимость нейтрализации антикоагулянтного эффекта у пациентов возникает во время угрозы кровотечения, возникающей при длительном приеме антикоагулянтов, а также при угрозе кровотечений, появляющейся при различных хирургических вмешательствах с использованием антикоагулянтов, при экстракорпоральном кровообращении при операциях на

142

открытом сердце или программном гемодиализе при заместительной терапии с использованием антикоагулянтов (Haverkamp et al., 2003; Schick et al., 2004;). Известна способность протамина сульфата нейтрализовать антикоагулянтную активность нефракционированного и некоторых низкомолекулярных гепаринов. Нейтрализация антикоагулянтного эффекта гепарина происходит за счет электростатического взаимодействия между отрицательно заряженным полисахаридом и положительно заряженным протамина сульфатом с возникновением комплекса (Ramamurthy et al., 1999).

Таблица 6.3

Антикоагулянтная активность плазмы крыс после внутривенного введения фукоиданов, выделенных из F. evanescens(I) и S. cichorioides(II)

Фукой -дан	Доза (мг/кг)	Активность (ЕД/мл)	Время после введения (мин)
			5	15	30	60	120	180
I	5	аХа Р	0,2±0,02* 0,035	0	0	0	0	0
		alia Р	2,3±0,23* 0,000	1,1±0,15* 0,000	1,3±0,34* 0,002	0,7±0,22* 0,012	0,6±0,2* 0,021	0,5±0,09* 0,000
	10	аХа Р	0,3±0,02* 0,000	0	0	0	0	0
		alia Р	2,5±0,36* 0,000	2,0±0,27* 0,000	1,7±0,15* 0,000	1,2±0,14* 0.000	0,7±0,09* 0,000	0,2±0,01* 0,022
II	5	аХа Р	0,81±0,06* 0,000	0,31 ±0,05* 0,003	0,12±0,03 1,000	0	0	0
		alia Р	2,8±0,25* 0,000	2,4±0,21* 0,000	2,1±0,22* 0,000	1,4±0,1* 0.000	1,1±0,09* 0,000	0,6±0,05* 0,000
	10	аХа Р	0,95±0,06* 0,000	0,77±0,05* 0,000	0,61 ±0,13* 0.000	0,43±0,09* 0.002	0,29±0,1 0,115	0,11±0,06 0,883
		alia Р	3,1 ±0,24* 0,000	2,7±0,21* 0.000	2,4±0,2* 0,000	1,6±0,11* 0,000	1,3±0,13* 0,000	0,9±0,08* 0,000
Контроль		аХа	0,12±0,03
		alia	0,10±0,04

Примечание: показатели M±m; p — значимость различий показателей в опыте по сравнению с контролем; использован параметрический t-критерий Стьюдента; п=15; (*р<0,05) — различия статистически значимы по отношению к контролю.

143

"



/>




1a 26 Зв 4г 5д 6а 76

9г 10д 11а 126 13в 14г 15д

Рис. 6.1. Комплексообразование с сульфатом протамина фукоиданов из F. evanescencs

(I) (6—10) и S. cichorioides(II) (11—15) в сравнении с гепарином (1—5) в геле агарозы.

Концентрация фукоиданов и гепарина (мг/мл): а — 0,31; б — 0,63;

в- 1,25; г - 2,5; д-5,0

На рис. 1 представлено сканированное изображение результата электрофореза образцов фукоиданов в агарозном геле, в который добавлен протамина сульфат. Зоны преципитации окрашенных комплексов полисахарид-белок имеют вид ракеток. Фукоиданы I и II, внесенные в гель в концентрации от 31 до 500 мкг/мл образуют комплексы с протамина сульфатом. Установлено, что чем больше концентрация, тем больше высота и площадь пика преципитации (рис. 6.1). Коэффициенты корреляции между высотой и площадью пиков преципитации в отношении как I, так и II образцов фукоиданов значительны и составляют г=0,97±0,05 (р=0,002) и г=0,98±0,07 (р=0,001), соответственно.

Таким образом, фукоиданы способны создавать комплексы с известным для гепаринов антидотом — протамина сульфатом.

Важной характеристикой препаратов, применяемых в качестве тромбо-литических средств является усиление фибринолиза. В связи с этим нами исследовано влияние фукоидана на систему фибринолиза в тесте спонтанного эуглобулинового лизиса, скорость которого отражает количество плаз-миногена и степень его активации в плазме, а также путем количественного определения плазминогена на основе гидролиза хромогенного субстрата, свидетельствующего о потенциальной активности плазминовой системы.

Как известно, время лизиса эуглобулинов отражает активный потенциал плазминовой системы. Укорочение времени лизиса сгустка свидетельствует

144

об активации фибринолиза, а активация фибринолиза соответствует увеличению активности и количества плазминогена — неактивного предшественника плазмина — фермента, расщепляющего фибрин и ФГ (Баркаган, Момот, 2001; Макаров, Горбунова, 2003).

В экспериментах invitroбыло установлено, что фукоидан во всем диапазоне исследуемых концентраций (10-1000 мкг/мл) способствовал возрастанию уровня основного компонента фибринолитической системы — плазминогена. Максимальное количество плазминогена (вдвое превышающее контрольные показатели, р<0,05) зарегистрировано при действии фукоидана в концентрации 1000 мкг/мл (табл. 6.4).

Таблица 6.4 Влияние фукоидана из F. evanescensна уровень плазминогена в плазме

доноров (in vitro)

Концентрация фукоидана (мкг/мл)	Концентрация плазминогена (%)	ИС
1000	198,2±12,6* р<0,05	2,2
500	175,0±5,8* р<0,05	1,9
100	160,0±4,2* р<0,05	1,7
50	131,0±5,4* р<0,05	1,4
10	128,0±4,6* р<0,05	1,4
Контроль	92,0±3,5

Примечание: показатели Ме±т; ИС — индекс стимуляции — рассчитан как показателей в опыте и контроле; р — значимость различий показателей в опыте по сравнению с контролем по результатам дисперсионного анализа (*р<0,05); п=6; использован непараметрический Q-критерий Данна.

Исследование показателей фибринолиза через 30 мин после однократного введения фукоидана мышам показало незначительное усиление скорости спонтанного эуглобулинового лизиса и увеличение уровня плазминогена в сыворотке крови по сравнению с контрольной группой (р<0,05). При 10-кратном введении фукоидана наблюдалась более интенсивная активации фибринолиза (р<0,05) и увеличение уровня плазминогена в 2,7 раза по сравнению с контролем (р<0,05) (табл. 6.5).

145

При исследовании уровня фибриногена (ФГ) в сыворотке крови у животных этой группы статистически значимых изменений не выявлено (р>0,05) (табл. 6.5).

Таблица 6.5 Влияние фукоидана из F. evanescensна показатели фибринолитической системы и уровень фибриногена у мышей BALB

/c в зависимости от

кратности введения

Показатель гемостаза (Ме±т)	Группа животных
	Контрольная	Фукоидан 1-кр. в/б	ИС	Фукоидан 10-кр. в/б	ИС
ФА (мин)	270±18	240±11	0,9	210±10*	0,8
		р>0,05		р<0,05
ФГ (г/л)	4,1±0,2	3,5±0,2	0,85	3,5±0,1	0,85
		р>0,05		р>0,05
Уровень плаз-миногена (%)	75,0± 3,9	172,817,1*	2,3	200,0±13,3*	2,7
		р<0,05		р<0,05

Примечание: показатели гемостаза Ме<т; ИС — индекс стимуляции- рассчитан как отношение показателя в опыте к контролю; р-значимость различий показателей в опыте по сравнению с контролем; п=5; использован непараметрический Q-критерий Данна; р — значимость различий по результатам дисперсионного анализа (*р<0,05).

Представленные результаты свидетельствуют о том, что фукоиданы, выделенные из бурых водорослей F. evanescensи S. cichorioid.es, обладают свойствами антикоагулянтов прямого типа действия.

Исследование механизмов антикоагулянтной активности позволило установить эффективное влияние этих фукоиданов на факторы внутреннего и внешнего путей свертывания, а также на конечный этап свертывания или превращение фибриногена в фибрин под воздействием тромбина.

Антикоагулянтная активность фукоидана из F. evanescensсвязана с плазменным AT III. Фукоидан, как и гепарин, превращает AT III из медленно действующего в быстродействующий ингибитор тромбина.