Автореферат: Биохимические механизмы дезинтеграции эритроцитов человека в различных условиях функционирования

Для более детального выявления механизма стабилизирующего действия бета-блокаторов на эритроцитарные клетки, нами было изучено действие обзидана на фоне гиперадреналинемии. Мы использовали 20-ти кратную физиологической концентрацию адреналина и разовую терапевтическую дозу обзидана. Инкубация эритроцитов у этих условиях сопровождается увеличением количества лиганда, адсорбированного на мембране эритроцитов (рис.3). Это дает возможность предположить, что в начальный период времени обзидан эффективно связывается бета-адренорецепторами эритроцитарной мембраны, а затем постепенно вытесняется лигандом. Десенситизация рецепторов в присутствии обзидана идет более медленно за счет связывания антагониста, а высокая скорость разрушения адреналина по сравнению с временем полувыведения обзидана дает возможность для стабилизации мембраны, приводит к уменьшению подвижности аннулярного слоя липидов вокруг бета-блокатора ( Дворянин Г.Ф. и др, 1980) и затруднению интернализации рецептора. Уменьшение скорости интернализации рецепторов с одной стороны, создает возможность связывания с ними лиганда и уменьшения интенсивности действия адреналина на бета-рецепторы сосудов, с другой стороны, снижает скорость повреждения эритроцитарной мембраны.

Рис.3. Количество адреналина в экстрактах эритроцитов и плазмы. 1- Адреналин+обзидан, эритроциты; 2- адреналин, эритроциты; 3- адреналин, плазма; 4. Адреналин+обзидан, плазма.

Увеличение концентрации адреналина в плазме крови у больных ИБС обычно происходит на фоне хронической гипоксии и лактоацидоза. Многолетние исследования, проводимые нами, выявили у больных ИБС превышение уровня содержания молочной кислоты в плазме крови до 2,5-3 мМ/л против 1,0-1,5 мМ/л у ПЗЛ.

Инкубация эритроцитов в среде, содержащей 10-ти кратную физиологической концентрацию адреналина и 7,5 мМ молочной кислоты сопровождается ростом скорости метгемоглобинобразования и доли мембраносвязанной фракции белка, увеличением активности фосфолипазы А₂ и 5`-нуклеотидазы в мембранах клеток, снижением сродства гемоглобина к кислороду. Добавление обзидана в инкубационную среду приводит к уменьшению процента метгемоглобина и мембраносвязанного гемоглобина. Понижаются активные концентрации фосфолипазы А<sub>2</sub> и 5`-нуклеотидазы, что свидетельствует об уменьшении степени деградации мембранных фосфолипидов (Рожковский Я.В., Кресюн В.И., 1991). В целом действие обзидана на эритроциты в условиях гиперадреналинемии и лактоацидоза можно оценить как благоприятное, уменьшающее повреждающее воздействие избытка адреналина и молочной кислоты. Однако, при этом наблюдается значительное снижение сродства гемоглобина к кислороду, что может привести к массовой его потери по пути к капиллярам и будет способствовать усугублению гипоксии.

5. Влияние триметазидина и N-(2-оксиэтил)-амида-цис-9-октадеценовой кислоты на скорость дестабилизации эритроцитарных клеток в условиях гипоксии и лактоацидоза

В условиях гипоксии и лактоацидоза в эритроцитах значительно снижается сродство гемоглобина к кислороду, ускоряется процесс метгемоглобинобразования, снижаются темпы производства АТФ, что приводит к ускорению процессов дестабилизации мембраны и развитию ПОЛ. Оптимизация обменных процессов и регуляция ионной проницаемости клеток может способствовать замедлению развития дезинтеграции мембран и нарушению функциональной активности клеток.

В качестве соединений , обладающих возможным протекторным действием, нами были выбраны триметазидин (предуктал), улучшающий метаболизм глюкозы (William C.S., 1999) и уже применяемый как лекарственный препарат, и N-(2-оксиэтил)-амид-цис-9-октадеценовая кислота (олеоилэтаноламин), регулятор работы кальциевых каналов, исследованный только в эксперименте на кардиомиоцитах морских свинок (Epps D.E., 1983).

Действие триметазидина в разовой терапевтической дозе изучали в условиях лактоацидоза различной степени выраженности 7,5; 10; 20 мМ/л. Как в условиях умеренного (7,5 мМ), так и в условиях сильного ацидоза, триметазидин снижал скорость метгемоглобинобразования, наблюдалось уменьшение активной концентрации НАДН-цитохром-b₅-редуктазы, основным субстратом которой служат перекиси жирных кислот, снижение доли мембраносвязанного гемоглобина (табл.7).

Подобные изменения мы наблюдали и при действии триметазидина на храненную в течение 3-х суток кровь, где эритроцитарные популяции повреждены не только действием лактоацидоза, но и состоянием энергодефицита.

Проведение исследований состояния эритроцитов у больных ИБС, ССН III функционального класса, получавших кроме традиционной антиангинальной терапии триметазидин (предуктал, 60 мг/сутки) показало, что количество поврежденных клеток у данной группы больных уменьшалось: отмечается снижение процента метгемоглобина, мембраносвязанного гемоглобина , повышается ферментативная активность гемолизатов, уменьшается скорость химического окисления гемоглобина.

Следует также отметить увеличение АОА плазмы у данной группы больных по сравнению с больными, не получавшими предуктал (табл.8). Уменьшение свободно-радикального окисления в плазме будет способствовать снижению скорости дезинтеграции эритроцитарных клеток и улучшению их функциональной активности.

Таблица 7.

Действие сильного ацидоза на донорскую кровь в присутствии разовой дозы триметазидина

Примечание *P<0,01 по отношению к контролю; **P<0,01 по отношению к пробе с молочной кислотой

Таблица 8.

Показатели состояния эритроцитарных популяций и АОА плазмы крови у больных ИБС, ССН III функционального класса, леченных традиционно и с применением предуктала

Примечание *P<0,01 по отношению к больным, получавшим только традиционное лечение

Учитывая важность оптимизации работы ионных каналов клетки в поддержании интегрированной деятельности всех систем, мы изучили действие N-(2-оксиэтил)-амида-цис-9-октадеценовой кислоты (олеоилэтаноламина) на эритроцитарные клетки в условиях лактоацидоза (7,5 мМ) и без него. Как показали данные тонкослойной хроматографии, олеоилэтаноламид (ОЭА) при добавлении его в цельную кровь, обнаруживался в равной степени в мембране и в цитозоле клеток ( через 30 минут инкубации при 37⁰С). Внедрение ОЭА в мембрану сопровождается увеличением деформируемости, повышением осмотической резистентности и снижением мембранной проницаемости для мочевины (табл.9). Эластичность и вязкостные свойства мембран эритроцитов определяются состоянием спектрин-актиновых комплексов и эффективностью их взаимодействия с белком п.3 и анкирином (п.4.1). Нормальные взаимодействия осуществляются при оптимальном соотношении АТФ, 2,3 ДФГ, ионов Са²⁺ и Mg²⁺ (Bloch R.J., Pumplin D., 1992).

Можно предположить, что ОЭА улучшает белок-белковые взаимодействия за счет оптимизации работы кальциевых каналов, что приводит к стабилизации мембранных структур. Кроме того, наблюдается низкая скорость аутоокисления гемоглобина, не изменяется сродство гемоглобина к кислороду, эритроцитарная популяция отличается высоким фоном активностей ЛДГ, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, каталазы, что может свидетельствовать об улучшении эффективных белок-белковых и белок-липидных взаимодействий и снижению скорости денатурационных процессов. Однако нами было обнаружено снижение активности СОД эритроцитарных экстрактов. Регуляция активности, а также условия нахождения данного фермента в эритроцитах до настоящего времени изучено недостаточно. Если предположить, что в эритроцитах большая часть фермента находится в неактивной форме , а активация происходит в условиях ускорения производства супероксида, то при низкой скорости аутоокисления гемоглобина большая часть фермента останется латентной.

В условиях лактоацидоза (7,5 мМ) ОЭА в изученной концентрации (6 мкг/мл) снижает повреждающее действие избытка молочной кислоты (табл.9). Мы наблюдали снижение скорости метгемоглобинобразования, улучшение показателей состояния мембраны и цитоскелета : осмотической резистентности, мембранной проницаемости, деформируемости.

Таблица 9.

Показатели состояния эритроцитов при инкубации цельной крови доноров при 37⁰С, 20 минут в присутствии олеоилэтаноламина, n=15

Примечание *P<0,01 по отношению к контролю; **P<0,01 по отношению к пробе с молочной кислотой

Возможно, ОЭА увеличивает подвижность белка п.3, что сопровождается повышением эластичности мембраны. Об улучшении белок-белковых взаимодействий в присутствии ОЭА свидетельствует повышение активных концентраций ферментов: ЛДГ, каталазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы; увеличение скорости поглощения глюкозы эритроцитами.

Таким образом, этаноламидное производное олеиновой кислоты, проникая в фосфолипидный слой мембраны, действует стабилизирующе на белок-белковые и белок-липидные взаимодействия и снижает скорость процессов повреждения клеток в условиях избытка молочной кислоты.

6. Механизмы дезинтеграции эритроцитов в условиях окислительного стресса и реоксигенации

Повреждающее, а также регулирующая роль активных форм кислорода (АФК) в настоящее время привлекает активное внимание многих исследователей. Уровень производства АФК в клетках определяет их метаболическую активность, скорость старения, гибели или пролиферации (Зенков Н.К. и др.,1999; Скулачев В.П., 1999; Гамалей И.А., 2000; Самуилов В.Д., 2000; Лю Б.Н., 2002). АФК производятся как в процессах оксигенации, так и в условиях гипоксии, когда этот процесс вторичен и обусловлен избытком восстановленных эквивалентов при участии Fe²⁺. Но наиболее значительным производство АФК становится в условиях перехода от состояния гипоксии к нормооксии и гипероксии - при реоксигенации ( Скулачев В.П., 1999).

Эритроциты представляют собой клетку, где производство АФК происходит постоянно и в большом количестве, так как с этим связано выполнение одной из главных функций - отдача кислорода. Это объясняет хорошо отлаженную систему антирадикальной защиты клеток: большое количество каталазы и СОД, наличие глутатионредуктазной и глутатионпероксидазной систем, антиокислительная активность самого гемоглобина ( Заводник И.Б. и др.,1992,1996; Ворожцова Е.Е. и др.,1999).

Нами были изучены механизмы повреждения эритроцитов, инкубированных в условиях окислительного стресса, имитирующего гипоксию, при которой возникает избыток Fe²⁺ (Rise-Erans C., Bay-Sal E.,

1987)(модель 1), а также сочетание избытка Fe²⁺ с желточными липопротеидами (Клебанов Г.И. и др., 1988)(модель 2). Инкубация эритроцитов с инициаторами окисления приводила к ускорению метгемоглобинобразования, снижению сродства гемоглобина к кислороду, о чем свидетельствовали рост процента метгемоглобина, увеличение производства 2,3 ДФГ и уменьшение доли оксигемоглобина. Повышается уровень молочной кислоты в эритроцитах на фоне снижения активных концентраций глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (табл.10). В мембранах ускоряются процессы производства переокисленных продуктов жирных кислот и холестерина, наблюдается снижение АОА и каталазной активности эритроцитарных гемолизатов. Присутствие желточных липопротеидов низкой плотности (модель 2) приводит к возрастанию процента поврежденных клеток в популяции, поскольку выявляется большее содержание метгемоглобина, мембраносвязанного гемоглобина, в большей степени снижается сродство гемоглобина к кислороду.