20. Особенности ферментативного катализа. Специфичность ферментов
Согласно теории Михаэлиса-Ментен фермент (Е) соединяется со своим субстратом (S), образуя нестойкий промежуточный комплекс (ES), который в конце реакции распадается с освобождением фермента и продуктов реакции.
Поэтому всю последовательность каталитического ферментативного процесса можно представить следующим образом:
где ЕХ - истинный активированный комплекс (переходное состояние); ЕР - комплекс фермента с продуктом.
Специфичность ферментов
Под специфичностью ферментов понимают способность каждого из них катализировать одну или несколько близких по природе химических реакций. Различают следующие типы специфичности.
1. А б с о л ю т н а я с п е ц и ф и ч н о с т ь. При этом типе специфичности фермент катализирует превращение только одного субстрата. Фермент каталаза катализирует расщепление пероксида водорода на воду и кислород; ее действие ограничивается только этим субстратом.
2. Г р у п п о в а я с п е ц и ф и ч н о с т ь. Основным признаком для ферментов этого типа специфичности служит характер разрушаемой или создаваемой связи в близких по строению группах веществ. К ферментам с групповой специфичностью относятся липазы, катализирующие гидролиз сложных эфиров глицерина и карбоновых кислот; фосфатазы, действующие на эфиры фосфорной кислоты; пептидгидролазы, катализирующие гидролиз пептидных связей в белках и пептидах и др.
3. С т е р е о х и м и ч е с к а я с п е ц и ф и ч н о с т ь. Ферменты этого типа специфичности действуют на определенный изомер одного и того же вещества: D- или L-, - или -, транс- или цис-. Пептидгидролазы действуют только на пептиды, образованные аминокислотами L-ряда.
Наличие субстратной специфичности объясняют две гипотезы:
Теория Фишера (модель "жесткой матрицы", "ключ-замок") - активный центр фермента строго соответствует конфигурации субстрата и не изменяется при его присоединении. Эта модель хорошо объясняет абсолютную специфичность, но не групповую. 2. Теория Кошланда (модель "индуцированного соответствия", "рука-перчатка") - подразумевает гибкость активного центра. Присоединение субстрата к якорному участку фермента вызывает изменение конфигурации каталитического центра таким образом, чтобы его форма соответствовала форме субстрата.
21. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента и субстрата
Влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции
Эта кривая описывается уравнением Михаэлиса-Ментен:
При постоянной концентрации фермента начальная скорость реакции растет пропорционально увеличению концентрации субстрата (реакция первого порядка для низких концентраций субстрата). При высоких концентрациях скорость реакции достигает своего максимального значения (Vmax) и не зависит от концентрации субстрата (реакция нулевого порядка).
Км -- это константа Михаэлиса. Она численно равна той концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину от максимального значения. С помощью Км можно характеризовать сродство данного фермента к данному субстрату. Чем меньше Км, тем больше сродство фермента к данному субстрату. Если Км высока, то это означает, что сродство фермента к такому субстрату низкое и реакция при небольших концентрациях субстрата протекает неэффективно.
Влияние концентрации фермента на скорость ферментативной реакции
При высокой концентрации субстрата и при постоянстве других факторов скорость ферментативной реакции зависит от концентрации фермента. При построении графика эта зависимость будет линейной.
22. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры и рН среды
Зависимость скорости реакции от температуры
Зависимость активности ферментов (скорости реакции) от t описывается колоколообразной кривой с максимумом скорости при значениях оптимальной t для данного фермента. При 0°С реакция не идет.
Закон о повышении скорости реакции в 2-4 раза при повышении t на 10°С справедлив и для ферментативных реакций, но только в пределах до 55-60°С, т.е. до t денатурации белков. (имеются ферменты некоторых м/о, существующих в воде горячих источников и гейзеров).
Наивысшую активность ферменты обычно проявляют в очень узком интервале температур (40-50С). До этого интервала с повышением температуры скорость катализируемой ферментами реакции повышается.
Зависимость скорости реакции от рН
Для каждого фермента существует оптимальное значение рН, т.е. такая величина рН, или зона рН, при которой катализируемая ферментом реакция протекает с наибольшей скоростью (рис.). Например, оптимальные значения рН для пепсина 1,5-2,5 - платинообразный график, трипсина 8,0-8,5, амилазы слюны 7,2 - колокообразный гр., аргиназы 9,7 пикообразный гр., кислой фосфатазы 4,5-5,0. Большинство ферментов имеют максимальную каталитическую активность в зоне рН от 6 до 8; в резко кислой или резко щелочной среде работают лишь некоторые ферменты.
За пределами оптимальной зоны рН, т.е. при отклонениях в сторону снижения или в сторону повышения от этого значения, скорость ферментативной реакции снижается.
Рис.пепсин (1) и сахароза из дрожжей (2).
23. Различия ферментативного состава органов и тканей, изменение активности ферментов в онтогенезе и при болезнях. Понятие об энзимопатиях
Классификация изоферментов: а) по органной локализации -- ферменты гликолиза в мышцах и цитоплазме; б) по внутриклеточной локализации -- малатдегидрогеназа митохондриальная и цитоплазматическая; в) изоферменты, образующиеся в результате мутаций структурных генов; г) гибридные формы, образующиеся путем нековалентного связывания нескольких разных по структуре полипептидных цепей. Так, ЛДГ состоит из 4-х цепей 2-х видов -- H и M. Из них возможно образование пяти изоферментов -- Н4, Н3М, Н2М2, МН3 и М4. Н4 и Н3М преобладают в миокарде, а М4 -- в печени.
Гидролазы. Широко представлены ферментами желудочно-кишечного тракта и лизосомальными ферментами. Осуществляют распад макромолекул, образуя легко адсорбируемые мономеры.
В случае, если фермент не может выполнять свою функцию, говорят об энзимопатологии (энзимопатии) - состояния, связанные с патологическим изменением активности ферментов.
Первичные (наследственные) энзимопатии связаны с генетическим дефектом и наследственным снижением активности. Например, фенилкетонурия связана с дефектом фенилаланин-4-монооксигеназы, которая превращает фенилаланин в тирозин. В результате накапливаются аномальные метаболиты фенилаланина, оказывающие сильный токсический эффект. Заболевание подагра связано с дефектом ферментов метаболизма пуриновых оснований и накоплением мочевой кислоты. Алкаптонурия - нарушено окисление гомогентизиновой кислоты в тканях (гомогентизиновая кислота - промежуточный метаболит катаболизма тирозина). У таких больных наблюдают недостаточность фермента окисления гомогентизиновой кислоты - диоксигеназы гомогентизиновой кислоты, приводящей к развитию заболевания. В результате увеличиваются концентрация гомогентизиновой кислоты и выведение её с мочой. В присутствии кислорода гомогентизиновая кислота превращается в соединение чёрного цвета - алкаптон. Поэтому моча таких больных на воздухе окрашивается в чёрный цвет.
Вторичные (приобретенные) энзимопатии возникают как следствие заболеваний органов, вирусных инфекций и т.п., что приводит к нарушению синтеза фермента или условий его работы, например, гипераммониемия при заболеваниях печени, при которых ухудшается синтез мочевины и в крови накапливается аммиак. Другим примером может служить недостаточность ферментов желудочно-кишечного тракта при заболеваниях желудка, поджелудочной железы или желчного пузыря.
Недостаток витаминов и их коферментных форм также является причиной приобретенных ферментопатий.
24. Понятие об эффекторах. Активирование и ингибирование ферментов. Механизм
Эффекторы - любые хим. соед-ия, кот-е непоср-но связ-ся с ферментом и изменяют его активность.
И н г и б и т о р а м и называют вещества, вызывающие частичное или полное торможение химических реакций, включая и ферментативные. Механизм действия ингибиторов в общей форме: ингибитор вступает в соединение с ферментом, образуя соединение фермент-ингибитор. Различают о б р а т и м о е и н е о б р а т и м о е ингибирование фермента. При обратимом ингибировании активность фермента восстанавливается по мере удаления свободного ингибитора диализом или иным способом. При необратимом ингибировании активность фермента не удается восстановить диализом. Напротив, если ингибитор присутствует в избытке по сравнению с ферментом, то со временем наступает полное торможение активности фермента.
По механизму действия виды ИНГИБИРОВАНИЯ:
1. Конкурентное ингибирование - это торможение ферментативной реакции, вызванное связыванием с активным центром фермента ингибитора, который по своей структуре близок к структуре субстрата.
2. Неконкурентное ингибирование вызывают вещества, не имеющие структурного сходства с субстратом. Причем эти вещества обратимо присоединяются к ферменту не в активном центре, где обычно связывается субстрат, а совсем в другом месте и, следовательно, конкуренция между субстратом и ингибитором отсутствует.
3.Субстратное ингибирование - это торможение ферментативной реакции, вызванное избытком субстрата.
4. Аллостерическое ингибирование характерно для ферментов, имеющих четвертичную структуру, молекула которых состоит из нескольких единиц (протомеров). Аллостерические ферменты могут иметь 2 и более единиц. При этом одна имеет каталитический центр и называется каталитической, а другая - аллостерический центр и называется регуляторной. В отсутствии аллостерического ингибитора субстрат присоединяется к каталитическому центру, и идёт обычная каталитическая реакция. При появлении аллостерического ингибитора, он присоединяется к регуляторной единице, и изменяет конформацию центра фермента, в результате этого активность фермента снижается.
А к т и в а т о р ы - вещества, увеличивающие каталитическую активность ферментов. Роль активаторов ферментов выполняют ионы металлов: калия, кальция, магния, цинка, меди, железа, марганца, кобальта, а из анионов - хлора. Усиление активности ферментов под действием ионов металлов объясняется тем, что в одних случаях ионы металлов выполняют роль кофактора, в других - облегчают образование фермент-субстратного комплекса, в третьих - способствуют прсоединеию кофермента к апоферменту, в четвертых обеспечивают становление четвертичной структуры фермента или же действуют иными путями.
Активный центр ферментов, теории его конформации
Активный центр - комбинация аминокислотных остатков (обычно 12-16), обеспечивающая непосредственное связывание с молекулой субстрата и осуществляющая катализ. Аминокислотные радикалы в активном центре могут находиться в любом сочетании, при этом рядом располагаются АК, значительно удаленные друг от друга в линейной цепи, но сближенные в функциональной конформации. Наиболее часто в состав активного центра входят такие АК как серин, гистидин, трионин, цистеин.
Активный центр обычно располагается в гидрофобном углублении (недоступном для молекул воды), изолируя субстрат от воды. В образовании активного центра, участвуют боковые группы АК.
Остальные АК поддерживают пространственную конфигурацию активного центра фермента и обеспечивают его реакционную способность.
Контактный (субстрат-связывающий ) участок - это место в активном центре фермента, где происходит связывание субстрата с его активным центром. Контактный участок обеспечивает специфическое сродство субстрата к ферменту.
Каталитический участок - место, где проходит сама каталитическая реакция.
Теории коформации фермента и субстрата:
1. Теория Фишера (модель "жесткой матрицы", "ключ-замок") - активный центр фермента строго соответствует конфигурации субстрата и не изменяется при его присоединении. Эта модель хорошо объясняет абсолютную специфичность, но не групповую. 2. Теория Кошланда (модель "индуцированного соответствия", "рука-перчатка") - подразумевает гибкость активного центра. Присоединение субстрата к якорному участку фермента вызывает изменение конфигурации каталитического центра таким образом, чтобы его форма соответствовала форме субстрата.
25. Регуляция активности ферментов и ее виды. Аллостерическая регуляция. Физиологическое значение регуляции активности
Основные способы регуляции активности ферментов:
1. Доступность субстрата или кофермента. Скорость, с которой вещества реагируют друг с другом, зависит от их концентрации.
2. Компартментализация - это сосредоточение ферментов и их субстратов в одном компартменте (одной органелле) - в эндоплазматическом ретикулуме, митохондриях, лизосомах.
3. Изменение количества фермента может происходить в результате увеличения или снижения его синтеза. Изменение скорости синтеза фермента обычно зависит от количества определенных гормонов или субстратов реакции.