Материал: Методы лабораторной диагностики бактериальных менингитов (менингоэнцефалитов) Учебно-методическое пособие

Физико-химические свойства ликвора

Определение с помощью диагностических полосок Капля аккуратно размешанного ликвора наносится на соответствующую ре-

активную зону с помощью пипетки. Ликвор сразу пропитывает пористую подушечку, окраска которой изменяется в зависимости от концентрации определяемого вещества.

С помощью диагностических зон полифункциональных полосок можно определить относительную плотность, кровь (гемоглобин), лейкоциты (нейтрофилы), билирубин, глюкозу, кетоны и нитраты. рН ликвора нужно определять, используя рН-метр.

Общий белок определяют турбидиметрическими методами (изменение мутности при добавлении трихлоруксусной или сульфосалициловой кислоты и сульфата натрия), колориметрическими методами (метод Лоури, метод Бредфорд с краской Кумасси G250, метод пирагаллоловый красный) и с использованием диагностических полосок.

Общие сведения о физико-химических свойствах ликвора в норме и его составе отображены в таблице 2.

Таблица 2

Физические свойства и состав ликвора в норме

Микроскопия ликвора проводится с целью определения цитоза – общего количества клеточных элементов в 1 мкл или в 1 мл ликвора с последующей дифференциацией клеточных элементов (ликворная формула), а также в некоторых случаях для подсчета эритроцитов. Весьма важным является, чтобы подсчет количества форменных элементов в ликворе проводился в течении первых 30 минут после проведения люмбальной пункции. Этим обеспечивается наибо-

10

лее оптимальная количественная оценка полученных данных. При этом для подсчета лейкоцитов производят предварительное окрашиванием препарата одним из следующих реактивов:

1)5 мл 10% раствор ледяной уксусной кислоты + 0,1 метилового фиолетового + вода до 50 мл – время окрашивания составляет 2 минуты;

2)Реактив Самсона: 2,5 мл спиртового раствора фуксина 1:10 + 30 мл уксусной кислоты + 2 мл концентрированной карболовой кислоты + дистиллированной воды до 100 мл, время окрашивания составляет 10–15 минут.

После окрашивания препарат помещают в камеру Фукса-Розенталя объемом 3 мкл. Лейкоциты считают на малом увеличении во всех 16 больших (малых

256)квадратах. Е.М. Цветанова (1986) в случае большого плеоцитоза рекомендует считать клетки в больших квадратах. Если в них обнаруживают до 1000 клеток – в 8 больших квадратах (половина больших квадратов), результат умножить на 2; если до 3000 клеток – в 4 больших квадратах (один ряд), результат умножить на 4; если до 4000 клеток – в 2 больших квадратах, результат умножить на 8; если до 5000 клеток – в 1 большом квадрате, результат умножить на 16; если количество клеток очень большое, то считают в одном большом квадрате и умножают на 256. Полученное число затем делят на 3 (для оценки количества клеток в 1 мкл). Подсчет эритроцитов проводят в камере Горяева по правилам, аналогичным для подсчета эритроцитов крови.

Клеточные элементы ликвора оценивают в окрашенных азуром и эозином мазках, приготовленных из осадка обычного центрифугированного ликвора, на цитоцентрифуге или методом седиментации на аппарате Сайка. Клетки ликвора, кроме арахноэндотелиальных клеток и клеток эпендимы, имеют гематогенное происхождение и представлены лимфоцитами, моноцитами, нейтрофилами, редко эозинофилами, гистиоцитами (макрофагами), базофилами, плазматическими клетками, бластами, клетками эпендимы, арахноэндотелия, клетками опухолей.

МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

Важнейшую роль в диагностике менингитов (менингоэнцефалитов) играют микробиологические методы. Именно с помощью них удается установить этиологию заболевания и, соответственно, наиболее эффективно и рационально назначить антибактериальную терапию, исходя из чувствительности выделенных штаммов микроорганизмов к антибиотикам различных групп.

В качестве методов экспресс-диагностики может быть использована реакция латекс-агглютинации. Она может проводиться при обнаружении воспалительных изменений в ликворе для предварительной постановки диагноза. Для этого используют надосадочную жидкость, полученную после центрифугирования при 2000 об/мин предварительно прогретого в течение 5 минут до 100 °С ликвора. Каплю лакмусового реактива наносят на специальные карты и добавляют 30 мкл надосадочной жидкости. Полученную смесь перемешивают и оценивают формирование агглютинации. Наличие последней говорит о присутствии в пробе ликвора искомого антигена.

11

Еще одной методикой, применяющейся в экспресс-диагностике, является встречный иммуноэлектрофорез. Данный метод основан на движении друг к другу материала, содержащего антитела и антигены в поддерживающем геле под воздействием электрического поля с формированием преципитата. Учет результатов проводят с помощью увеличительного стекла в проходящем или падающем свете.

Нужно отметить, что методы экспресс-диагностики, к сожалению, не обладают достаточной эффективностью в детекции возбудителей заболевания, что предопределяет необходимость применения более сложных методов диагностики.

Одним из основных методов является микроскопический. Первоначально ликвор центрифугируют. Затем образец из осажденного слоя наносят на предметное стекло и высушивают в условиях термостата при 37 °С или при комнатной температуре. После этого на приготовленный препарат наносят водноспиртовой раствор красителя метиленового синего, проводят экспозицию в течение 2-х минут. По истечении указанного времени образец промывают водопроводной водой. Затем, дождавшись подсушивания препарата, проводят микроскопическое исследование с использованием иммерсионного объектива микроскопа (×1000). При этом просматривают не менее 20 полей зрения. Допускается микроскопическое исследование до обнаружения четко морфологически очерченных клеток микроорганизмов.

Микроскопическое исследование с окраской препарата по Граму

Проводят окрашивание по Граму в модификации Калины. Первоначально на обезжиренное стекло наносят около 0,05 мл стерильного физиологического раствора. Затем в него помещают биологический образец в аналогичном количестве. После этого вносят 0,02 мл спиртового раствора бриллиантовой зелени. Затем необходимо дождаться высыхания препарата при комнатной температуре. После этого препарат фиксируют в пламени горелки. Проводят окрашивание препарата по Граму по стандартной методике.

Приготовление препарата крови «толстая капля». Приблизительно на середину предметного стекла наносят каплю крови, которую затем с помощью стерильного аппликатора аккуратно и равномерно концентрически распределяют до достижения диаметра около 1,5 см. После высыхания препарата на образец наносят спиртовой раствор метиленового синего и выдерживают его в течение 2–3 минут. Затем препарат промывают проточной водой и высушивают при комнатной температуре. Микроскопическое исследование проводят с использованием иммерсионного объектива микроскопа (×1000). При этом просматривают не менее 20 полей зрения.

Полученные в ходе бактериоскопии данные должны быть в обязательном порядке подтверждены культуральными (бактериологическими) методами.

Для этих целей проводится посев ЦСЖ и крови. Непосредственно после проведения спинальной пункции образец ликвора помещают на поверхность шоколадного агара. На питательную среду вносят 3–4 капли ЦСЖ. После этого, чашку Петри закрывают и аккуратно равномерными круговыми движениями

12

распределяют ликвор по всей поверхности агара. Кроме того, 5–6 капель ликвора вносят в пробирку с 0,1 % полужидким сывороточным агаром. Чашки Петри и пробирки с клиническим материалом инкубируют в термостате при температуре 37 °С в течение 24–48 ч в условиях атмосферы, обогащенной СО2 до 5–10 %. После этого проводят идентификацию выделенных микроорганизмов до вида. Быстрой и точной является идентификация при помощи прямого белкового профилирования белков микроорганизмов, например MALDI-TOF масспектрометрия с использованием аппарата Bruker (Германия) с программным обеспечением Biotyper. После окончательной верификации возбудителей заболевания, определяют их чувствительность к антибиотикам различных групп. Рекомендуется определение минимальной подавляющей концентрации (МПК), для некоторых возбудителей допускается диско-диффузионный метод определения чувствительности к антимикробным препаратам.

Посев образцов крови выполняют во флаконы, содержащие «двухфазную» питательную среду, приводя соотношение крови к жидкой фазе к 1:10. После этого образцы крови инкубируют в термостате при температуре 37 °С в течение 5 суток. После этого ежедневно производится контроль образцов на предмет наличия роста бактерий, признаками которого является помутнение среды, появление осадков, хлопьев, газообразование. При отсутствии роста в течение 48 часов, проводят посев образцов на «шоколадный» агар. В случае отрицательных результатов роста при посеве инкубацию флаконов продолжают еще в течение 72 часов. При обнаружении роста микроорганизмов проводят микроскопическое исследование препаратов, окрашенных по Граму. После проведения микроскопического исследования выполняют посев на шоколадный агар для детекции менингококков, пневмококков и гемофильной палочки (рис. 2). В случае предварительного обнаружения при бактериоскопии иных возбудителей могут быть использованы другие питательные среды, такие как среда Эндо, среда Сабуро, желточно-солевой агар.

Рис. 2. Типичные колонии менингококка на шоколадном агаре.

13

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ВЫДЕЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

К АНТИБИОТИКАМ РАЗЛИЧНЫХ ГРУПП

Методы определения чувствительности микроорганизмов подразделяют на методы серийных разведений и диффузные методы. Методы серийных разведений в бульоне и агаре основаны на прямом воздействии антимикробного препарата (АМП) и количественном определении минимальной подавляющей концентрации (МПК) антибиотика по отношению к исследуемому микроорганизму. Диффузионные методы основаны на подавлении роста исследуемой культуры при диффузии из носителя антибактериального препарата в плотную питательную среду. Существуют две модификации диффузионного метода: дис- ко-диффузионный и Е-тест (рис. 3).

Рис. 3. Е-тест и диско-дифуззионный метод определения чувствительности микроорганизма к антимикробным препаратам.

Диско-диффузионный метод – качественный метод. Он позволяет отнести исследуемый микроорганизм к чувствительным (S), умеренно устойчивым (I) и устойчивым (R) штаммам. Благодаря простоте исполнения он является основным для практических лабораторий. Е-тест – количественный метод, непосредственно определяющий МПК антибиотика. Распространение получили тестсистемы для определения лекарственной чувствительности, в основе которых лежит метод микроразведений антибиотиков. Это позволяет стандартизировать подготовительные этапы исследования, оценивать результат визуально или с применением различных автоматизированных систем. Одной из разновидностей метода серийных разведений является метод, основанный на использовании двух концентраций антибиотика, соответствующих пограничным значениям МПК. Такая тест-система представляет собой пластиковую полоску с расположенными на ней двумя рядами лунок. Каждый антибактериальный препарат, представленный на полоске, в первой лунке содержит «малую» пороговую концентрацию лиофилизированного антибиотика, а во второй лунке «большую»

14