Материал: Методы лабораторной диагностики бактериальных менингитов (менингоэнцефалитов) Учебно-методическое пособие

пороговую концентрацию. Первая пара лунок не содержит антибиотик и служит для контроля роста исследуемой культуры. Последняя пара лунок нужна для дополнительного тестирования культуры на чувствительность к препаратам, не входящим в набор системы. Результат оценивают по наличию или отсутствию мутности (роста) в лунках. Наличие роста в лунках с «малой» и «большой» концентрацией антибиотика свидетельствует о резистентности культуры к данному антибиотику. Наличие роста в лунке с «малой» концентрацией препарата и отсутствием роста в лунке с «большой» концентрацией - указывает на умеренную устойчивость штамма. Отсутствие роста в обеих лунках позволяет отнести исследуемую культуру к чувствительным штаммам. Представляется перспективным использование тест-систем для определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, разрешенных к применению в Российской Федерации в установленном порядке.

МЕТОДЫ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфекционных материалах, тканях и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на способности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – это сложная серологическая ре-

акция, в которой выявляют неизвестные микробные антигены (АГ) с помощью известных сывороток (антител – АТ), меченных или связанных с флуорохромами. Возбуждаемое внешним излучением свечение позволяет обнаружить АГ при помощи люминесцентного микроскопа. В качестве стандартного флуорохрома обычно используют флуоресцеин-изотиоцианат (ФИТЦ), прочно связывающийся с глобулинами антител.

Различают две разновидности метода: прямой и непрямой (рис. 4). Прямой метод РИФ (ПИФ) основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии и вирусы в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся в клетках зеленым цветом (рис. 5).

Непрямой метод РИФ (НИФ) заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулинов (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

15

Рис. 4. Реакция ПИФ (А) и НИФ (Б) для обнаружения антител и антигенов.

Рис. 5. Вирус герпеса в ядрах эпителиальных клеток. ПИФ. Увеличение ×1000. Масляная иммерсия.

Другие серологические реакции для обнаружения специфических антигенов и антител

Реакция связывания комплемента (РСК) – это сложная многокомпонент-

ная серологическая реакция. В ней используют две конкурирующие системы АГ и АТ и один комплемент. Первую систему называют исследуемой или тестсистемой, вторую – индикаторной или гемолитической.

16

РСК заключается в том, что при соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент, т.е. происходит связывание комплемента комплексом АГ-АТ. Если же комплекс не образуется, то комплемент остается свободным. PCK проводят в две фазы: 1-я фаза – инкубация смеси, содержащей АГ + АТ + комплемент; 2-я фаза (индикаторная) – выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана (АГ) и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса АГ-АТ происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная). Если АГ и АТ не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит – антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз (реакция отрицательная). РСК имеет много компонентов, поэтому ставят несколько контролей. Все компоненты используют в эквивалентных количествах. Так же, как и другие серологические реакции, РСК применяют для серодиагностики и сероидентификации (рис. 6).

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) – (Indirect hemagglutination test) – метод выявления антигенов и антител, основанный на способности эритроцитов, на поверхности которых предварительно адсорбированы антигены или антитела, агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток или соответствующих антигенов (рис. 7).

При обнаружении антигенов реакция обозначается обратной пассивной ге-

магглютинацией – РОПГА (reversed passive hemagglutination test), а при обна-

ружении антител – пассивной гемагглютинацией – РПГА (passive hemagglutination test). РНГА нашла широкое применение для выявления серологических маркеров инфицирования вирусом гепатита В, особенно HBsAg и антител к нему.

В настоящее время разработаны различные методы изготовления эритроцитарных диагностикумов, отличающихся по способам сенсибилизации эритроцитов (с помощью танина, глютарового альдегида, хлористого хрома, риванола и т. п.), их видовой принадлежности (человека, барана, курицы, индюка и т. д.), вариантам постановки реакции (в планшетах для микротитрования, в пробирках, капиллярах и т. д.) и учета результатов (визуальный и инструментальный).

17

Эритроцитарные диагностикумы для выявления HBsAg и анти-HBs выпускаются многими предприятиями и фирмами как у нас в стране, так и за рубежом.

Рис. 7. РНГА для обнаружения антител или антигенов.

Чаще РНГА проводится в планшетах для микротитрования, в которых предварительно приготовляются разведения исследуемой сыворотки и контрольных образцов. После внесения эритроцитарного диагностикума и инкубации проводится учет результатов реакции. Положительными считают образцы, в которых происходит агглютинация эритроцитов, имеющая вид перевернутого “зонтика”. При отрицательной реакции – эритроциты оседают на дно лунки в виде кольца, диска или пуговки.

Для выявления антител или антигенов в биологических жидкостях может использоваться иммуноферментный анализ (ИФА).

ИФА (англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) – сложная серо-

логическая реакция – серодиагностика и сероидентификация с обязательным участием АТ меченных ферментами. Самый популярный в современных лабораториях иммунологический метод качественного или количественного определения различных низкомолекулярных соединений, макромолекул, вирусов

ипр., в минимальных концентрациях (нг/л) в основе которого лежит специфическая реакция антиген – антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для визуализации реакции.

Предполагали, что серологический метод основан на изучении сыворотки больного с целью определения в ней АТ. Однако впоследствии сфера применения серологического метода расширилась, т.к. разработаны высокочувствительные серологические реакции, предполагающие обнаружение как АТ, так и АГ не только в сыворотке крови больных, но в слюне, ликворе, эякуляте, моче

ив других биологических жидкостях. Серологические исследования имеют огромное практическое значение в современной клинической и лабораторной диагностике инфекционных, аутоиммунных, эндокринных и других заболеваний (рис. 8, 9).

18

Рис. 8. Общие принципы ИФА.

Рис. 9. Иммуноферментный анализ (ИФА).

19