Материал: 4808
16
РАБОТА 3. Генетическое равновесие в свободно скрещивающейся популяции при учете одной пары аллелей
Закономерность, которой должно подчиняться в панмиктической популяции распределение частот трех генотипических классов, контролируемых двумя аллелями одного аутосомного гена, была установлена в 1908 г. независимо друг от друга английским математиком Г. Харди и немецким медиком В. Вайнбергом. Внесем в решетку Пеннета частоты двух классов гамет с аллелями А и а, принимая свободное их комбинирование как результат случайного скрещивания родительских особей в панмиктической популяции.
Частоты гамет у |
р (А) |
q(а) |
|
маточных деревьев |
|||
|
|
||
|
|
|
|
р(А) |
р2(АА) |
pq(Аа) |
|
g(а) |
рq(Аа) |
q2(aa) |
Запишем частоты генотипических классов в потомстве. Просуммируем эти частоты, имея в виду, что их сумма, как и сумма частот аллелей p q , по определению, равна 1 (или 100 %):
p 2 ( AA) 2 pq( Aa) q 2 (aa) 1
Это выражение получило название закона, или правила Харди-Вайнберга.
Оно есть результат возведения в квадрат двучлена возможность определить вероятность содержания свободно скрещивающейся популяции.
p q 2 . Этот закон дает генотипов АА, Аа, аа в
Задание 1
1)Познакомиться с законом Харди-Вайнберга.
2)Вычислить частоты генотипов в популяции сосны обыкновенной Усманского бора, растения которой различаются по окраске семян.
Материал и оборудование:
1.Семена сосны обыкновенной.
2.Бумага
3.Карандаш
4.ЭКВМ.
Пояснения к заданию. У сосны обыкновенной черная окраска семян – доминантный признак (А), по отношению к белой (а) окраске, N – число особей в популяции, D – число гомозиготных особей с генотипом АА, R – число гомозиготных особей с генотипом аа, Н – число гетерозиготных особей с генотипом Аа.
17
Выполнение задания
1.Определить состав популяции. Он будет представлен следующей формулой: N D R H .
2.Вычислить число генов А и число генов а в данной популяции сосны обыкновенной по формуле А (число генов) = 2D+H, так как каждое растение D имеет два гена А, а каждое растение Н – один ген А.
Число генов а = 2R+H, так как каждое растение R имеет два гена а, а каждое растение Н – один ген.
3.Вычислить частоту (долю) генов А в популяции сосны. Она обозначается буквой р и вычисляется по формуле
р 2D H D 12 H .
2N N
4. Вычислить частоту генов в популяции по формуле
q 2R H R 12 H . 2N N
5. Пользуясь формулой Харди-Вайнберга, вычислить состояние равновесия в популяции при р=0,6 и q=0,4 и частоте генотипов АА=0,10, Аа=0,20
и аа=0,70.
Выполнение задания. Каждый студент выполняет задание самостоятельно, и после чего получает индивидуальное задание и вычисляет состояние равновесия в популяции при определенных частотах р и q. Сделать вывод.
В предложенном примере в популяции сосны обыкновенной во всех поколениях сохраняется соотношение генотипов с черной окраской семян АА=0,36, гетерозигот Аа=0,48 и с белой окраской аа=0,16. При этом сохраняется частота гена А – р = 0,6 и частота гена а – q = 0,4.
РАБОТА 4. Применение изоферментного анализа при изучении гетерогенности природных популяций
Химические реакции в живых организмах осуществляются при помощи катализаторов – ферментов. Ферменты – глобулярные (сферической формы) белки. В белках встречается двадцать типов аминокислот, чередование которых в белковой цепи определяет специфику фермента, то есть его биологическую функцию. Фермент подходит к субстрату, как ключ к замку. В настоящее время известно около 2000 ферментов, многие из них получены в кристаллической форме.
Строение молекулы пероксидазы. Пероксидаза – двухкомпонентный фермент, состоящий из активной группы, вступающей в химическое взаимодействие с субстратами, и коллоидального белкового «носителя»,
18
усиливающего каталитическое действие этой группы. Это глобулярный белок диаметром 50 Ǻ (Clementi, Palade, 1969).
Цели и задачи изоферментного анализа. Изоферментный анализ позволяет проводить характеристику растительных форм как в соматических, так и в репродуктивных тканях. Известно, что в исследуемых образцах формы ферментов экспрессируются кодоминантно, в отличие от полного и неполного доминирования (Менделевские признаки) морфологических признаков, которые проявляются иногда через скрытую форму. Кодоминирование – это явление, когда оба аллеля дают равноценный вклад в формирование фенотипа. Кодоминирование обычно выявляется на электрофореграммах ферментов. Это один из путей получения информации о генотипе, и он может служить для выявления полиморфизма белков. Задача данной работы состоит в том, чтобы познакомить студентов с изучением индивидуальной изменчивости у древесных растений.
Задание 1. Изучить различные формы березы по системам размножения (самофертильные, самостерильные формы).
Материал и оборудование.
1.Вертикальная электрофоретическая камера;
2.Источник постоянного электрического тока;
3.Набор реактивов;
4.Зимние почки разных форм березы повислой по уровню самофертильности;
5.Препаровальные иглы.
Методика для экстракции белков. Растительный материал (навески листьев) студенты растирают в предварительно охлажденной фарфоровой ступке в равном объеме (масса/объем) 100 мМ трис-HCl буфера, pH 7,5, содержащем в качестве защитной добавки и создания антиконвекционной среды 20 % сахарозу. Гомогенат центрифугируют (5′) при 8000 об/мин. В качестве лидирующего красителя используют БФС. До вхождения белковых образцов в разделяющий гель электрофорез проводили при постоянном токе 20 мА, затем – 40 мА. Электрофорез завершают, когда бромфеноловая метка достигала нижнего анодного конца гелей. Разделение белков проводят с помощью вертикального дискового электрофореза в трубках полиакриламидного геля при 4 °С в непрерывной системе, описанной Дэвисом (Davis, 1964). Пероксидазную активность в гелях определяют с использованием бензидина. Гели после окрашивания фотографируют. Для удобства интерпретации разделяющий гель условно поделен на 3 зоны:
Медленно движущиеся изоформы - S (slow) Rf = 0 – 0,25
Изоформы с промежуточным типом движения – I (intermediate) Rf = 0,26 – 0,5 Быстро движущиеся изоформы – F (fast) Rf = 0,51 – 0,75.
Определение Rf (относительной подвижности изоформы фермента в геле)
19
Для получения приведенных значений (универсальных для считывания)
применяли формулу Rf |
а х |
|
; |
|
0,75 |
||||
|
|
|||
где а – длина дорожки, мм; х – определяемая (универсальная) длина дорожки, мм;
0,75 – коэффициент, равный длине электрофоретической трубки (подбирается эмпирически);
Экспериментальная часть
Отобрать почки с каждой формы березы, 1-3 – самофертильные формы, 2 – самостерильная форма.
1.1 н HCl – 48,0 мл; Трис – 36,6 г; TEMED – 0,23 мл;
2.Акриламид – 30,0 г; МБА (метиленбисакриламид) – 0,8 г;
3.ПСА (Персульфат аммония) – 0,14 г;
Растворы для приготовления концентрирующего геля:
4.1 н HCl – 48,0 мл; Трис – 5,98 г; TEMED – 0,46 мл; pH 6,7
5.Акриламид – 10,0 г; МБА – 2,5 г;
6.РФ (рибофлавин) 4 г;
7.Сахароза – 40 %;
Электродный буферный раствор:
Трис – 6,0 г; Глицин 28,8 г; используют 10 % водный раствор. Проявление гелей на пероксидазу:
Приготавливают два раствора, а) и б) а) 1. Бензидин – 100 мг;
2.CH3COONa – 6 г;
3.ЛУК (ледяная уксусная кислота) 3 мл (подогреть);
4.С2Н5ОН (пищевой) – 50 % - 100 мл;
Порядок приготовления: 1-3-2-4, хранится в темноте.
б) Н2О2 – 0,98 мл; Н2О – до 100 мл;
Смешать перед проявлением 1 ч. а) + 1 ч. б); Функция концентрирующего геля – соответственно концентрирует
содержимое кармана (экстрагирующий буфер с ферментом + краситель) для дальнейшего прохождения и сегрегации изоформ на следующей стадии – стадии разделения.
Разделяющий гель – дифференцирует фракции ферментов по их электрическому заряду и/или по молекулярной массе.
Приготовление растворов. Растворы для приготовления разделяющего
геля:
Схематический рисунок полученного спектра пероксидазы при изоферментном анализе.
20
Формы березы пушистой
Форма 1 |
Форма 2 |
Форма 3 |
S
I
F
S – медленно движущиеся изоформы;
I – изоформы с промежуточным типом движения; F – быстро движущиеся изоформы.
1,3 – самофертильные формы, 2 – самостерильная.
Вывод: при сравнении указанных форм наибольшей изменчивостью (гетерогенностью) обладает форма № 1 (самофертильная), что говорит о большей приспособленности к изменению условий окружающей среды этих форм при применении данного метода генетического анализа.