Материал: Биоиндикация. Микробиологические методы исследования экосистем (90

ществами и используется при классификации качества воды, определении сапробности и категории трофности водоемов [1, 11].

Подсчет копиотрофов проводят путем высева проб воды на агаризованную питательную среду МПА (мясо-пептонный агар) или РПА (рыбо-пептонный агар). Среда РПА позволяет учесть особенности минерального состава природных вод [17].

Среды МПА и РПА содержат высокие концентрации органического вещества – более 4000 мг С/л. Однако содержание органического вещества в природных водах (1–15 мг С/л) намного ниже, чем в средах МПА и РПА. В связи с этим на таких питательных средах не вырастает большинство автохтонных водных микроорганизмов, которые являются олиготрофами3. Олиготрофы выигрывают конкуренцию при низком содержании органического вещества, поэтому для их учета используют обедненные органические среды МПА 1:10 (РПА 1:10), в которых концентрация углерода в 10 раз меньше, чем в стандартной среде МПА

(РПА).

Копиотрофы и олиготрофы представляют собой две экологотрофические группы гетеротрофных4 микроорганизмов и являются основными деструкторами органического вещества в водоемах. Их численность и соотношение позволяют оценить трофность водоема и могут служить индикаторами изменения его трофического состояния.

Дополнительную информацию о состоянии водоема дает анализ основных морфологических групп копиотрофов.

Цель работы – оценка качества воды поверхностного водоема по некоторым показателям бактериопланктона.

Задачи:

1.Определить численность копиотрофов в исследуемой пробе воды.

2.Определить численность олиготрофов в исследуемой пробе воды.

3.Провести анализ морфологических групп копиотрофов.

3Олиготрофы – от греч. oligos – малый и trophe – питание;

4Гетеротрофные организмы (от греч. heteros – другой и trophe – пи-

тание) – организмы, использующие в качестве источника углерода экзогенные органические соединения. Участвуют в минерализации органических соединений в биосфере.

6

4.Рассчитать индекс трофности воды в исследуемой точке.

5.На основании проведенных исследований оценить качество воды в исследуемой точке.

6.На основании результатов исследований, проведенных в разных точках, сделать обобщенный вывод о состоянии обследованного водоема.

Отбор проб воды для выполнения работы проводят в нескольких точках водоема, каждое звено студентов (3 – 4 человека) анализирует отдельную пробу. При обследовании реки точки отбора проб можно выбрать вдоль берега по течению на расстоянии не менее 500 м друг от друга или в местах наибольшего загрязнения. В последнем случае следует взять также контрольную точку в фоновом участке. Кроме того, можно изучать созданные специально в учебных целях модельные водоемы, которые заполнены водой и донными отложениями из природных водоемов, испытывающих ту или иную антропогенную нагрузку.

Для выполнения данной работы отводится два занятия. На первом занятии студенты делают все необходимые посевы (п. 1.1.1 и 1.1.2). На следующем обрабатывают результаты посевов: проводят подсчет численности копиотрофов и олиготрофов, рассчитывают индекс трофности, анализируют морфологические группы копиотрофов, делают вывод о состоянии обследованного водоема (п. 1.1.3–1.1.8).

Порядок выполнения лабораторной работы

1.1.1. Приготовление разведений

Численность гетеротрофных микроорганизмов в водоемах с неизвестной степенью загрязнения может быть достаточно велика, поэтому для получения на твердой питательной среде изолированных колоний необходимо перед посевом приготовить ряд последовательных десятикратных разведений проб воды. Серию разведений готовят в зависимости от предполагаемой степени загрязнения.

Разведения делают в стерильных пробирках, в которые заранее внесено по 9 мл стерильной дистиллированной воды. Стерильной пипеткой берут 1 мл исследуемой пробы воды и вносят в первую пробирку с 9 мл дистиллированной воды. Таким образом

7

получают первое разведение 1:10. Затем с помощью новой стерильной пипетки тщательно перемешивают содержимое пробирки, продувая воздух через пипетку, после чего этой же пипеткой берут 1 мл полученного разведения и переносят во вторую пробирку – это второе разведение 1:100 (1:102). Аналогично получают третье разведение 1:1000 (1:103) и т. д. (рис. 1).

Рис. 1. Схема приготовления разведений проб воды

Для приготовления каждого разведения обязательно используют отдельную пипетку. Пренебрежение этим правилом может привести к получению ошибочного результата, иногда в 100 и более раз превышающего истинный. Часть клеток, оставшаяся на стенках пипетки, может попасть в одно из последующих разведений, что и станет причиной получения завышенного результата.

1.1.2. Посев на твердые питательные среды

Из исходной пробы воды, а также из каждого разведения производят посевы глубинным способом в чашки Петри на две среды: РПА и РПА 1:10. На каждой чашке заранее должно быть подписано название среды и номер разведения. Все посевы делают в двух повторностях. Для этого стерильной пипеткой отбирают 2–4 мл воды из исходной пробы и вносят по 0,5–1 мл (в зависимости от предполагаемой степени загрязнения) в четыре стерильные чашки Петри, слегка приоткрывая крышки. Затем заливают две чашки расплавленной и охлажденной до 450 С средой РПА и две чашки – средой РПА 1:10. Круговыми движениями по столу осторожно перемешивают посев со средой, равномерно распределяя по всему дну, избегая образования пузырьков воздуха и попадания агара на края и крышку чашки. Дают среде за-

8

стыть, переворачивают чашки вверх дном и инкубируют в термостате 5–7 суток при 280 С. Точно так же делают посевы из каждого разведения пробы.

Расход среды на одну чашку около 10–15 мл. Тонкий слой агара увеличивает эффективность учета копиотрофов за счет лучших условий для роста аэробных и факультативно анаэробных бактерий, преобладающих в водоемах. Колонии вырастают более крупные, легко подсчитываемые на фоне прозрачного тонкого слоя агара. Ограничен рост расплывчатых колоний.

1.1.3. Подсчет колоний на чашках Петри

По истечении времени инкубации достают чашки с посевами из термостата, группируют их по средам (РПА и РПА 1:10) и по разведениям (проба, 1:10, 1:100 и т. д.), рассматривают посевы.

Подсчитывают количество выросших колоний микроорганизмов на поверхности питательного агара на всех засеянных чашках Петри. В каждом разведении находят среднее значение числа колоний n из двух повторностей n1 и n2. Результаты подсчета колоний заносят в таблицу (табл. 1).

Таблица 1

Подсчет числа колоний на чашках Петри

Если на чашках имеет место рост расплывчатых колоний, не распространившийся на всю поверхность, или выросло более 300 колоний, то поверхность чашки делят на секторы и подсчитывают колонии на одном секторе с последующим пересчетом на всю поверхность агаровой пластинки. В этих случаях в таблице отмечают «число колоний ориентировочно».

9

Если рост расплывчатых колоний распространился на всю поверхность чашки и подсчет невозможен, то в таблице отмечают «ползучий рост».

Если подсчет невозможен из-за слишком многочисленного роста, то в таблице записывают «сплошной рост».

1.1.4. Определение численности копиотрофов и олиготрофов

Для определения численности копиотрофов в 1 мл воды используют среднее число колоний n , выросших при посеве на среду РПА. Численность выражают в колониеобразующих единицах (КОЕ). При этом исходят из предположения, что отдельная микробная клетка является одной колониеобразующей единицей.

Оптимальным разведением считается то, при посеве из которого вырастает от 20 до 300 колоний на одной чашке. Если с увеличением разведения количество колоний закономерно уменьшается, то КОЕ действительно представлено одной клеткой и для расчета численности можно использовать то разведение, которое дает максимальное значение числа копиотрофов. Если эта закономерность нарушается, то нужно логическим путем установить причину (нестерильность посева, агрегированность бактериопланктона и т. п.) и взять то разведение, которое дает наиболее реальную картину.

Подсчет ведут по формуле:

NРПА = ( n + m) × r / V [КОЕ/мл],

где NРПА – численность копиотрофов, выросших на среде РПА; n – среднее число колоний на чашках Петри, засеянных из одного разведения; r – разведение, из которого произведен посев; V – объем посевного материала, мл; m – стандартная ошибка (или ошибка средней арифметической) [8, 19].

Величину m рассчитывают по формуле:

где σ2 − стандартное или среднее квадратическое отклонение; x − число чашек Петри одного разведения, используемых в опыте.

Величину σ2 рассчитывают по формуле:

10