Материал: Биоиндикация. Микробиологические методы исследования экосистем (90

ние, в котором еще наблюдается рост микроорганизмов, и устанавливают таким образом их титр11.

Для объектов с плоской поверхностью можно сделать расчет на единицу площади (см2) по формуле:

N = a×10n / V×S [КОЕ/см2],

где N – количество микроорганизмов; а – количество выросших колоний; n – порядковый номер разведения, из которого сделан посев; V – количество мл разведения, взятое для посева; S – площадь, с которой произведен смыв, см2.

При использовании метода отпечатков расчет числа микроорганизмов на единицу площади ведут по формуле:

N = a/S [КОЕ/см2],

где а – количество выросших колоний; S – площадь исследуемой поверхности (равна площади питательной среды бакпечатки), см2.

Полученные результаты сравнивают с установленными нормативами и на основании этого дают заключение об эпидемической опасности (безопасности) исследуемого объекта.

11 Титр – это наименьшее количество исследуемого материала (в миллилитрах – для жидких субстратов или в граммах – для твердых), в котором обнаружена хотя бы одна жизнеспособная клетка искомого санитарнопоказательного микроорганизма.

36

Приложение 1

Правила техники безопасности

при работе в микробиологической лаборатории

1.В лабораторию нельзя входить в верхней одежде, работать

влаборатории разрешается только в халате.

2.В лаборатории категорически запрещается употреблять еду, напитки и другие продукты.

3.Порядок работы со спиртовками.

3.1Открыть крышку спиртовки и поправить пинцетом фитиль так, чтобы он был вытянут в вертикальном положении.

3.2.Зажечь спиртовку и не приподнимать держатель фитиля

втечение всего времени ее горения.

3.3.Над горящей спиртовкой не наклоняться, не подносить к ней легковоспламеняющиеся предметы (бумагу, вату и т. п.).

3.4.После окончания работы прекратить горение спиртовки, накрыв пламя крышкой.

4. Работа с бактериальными культурами.

4.1.Клетки микроорганизмов для приготовления препаратовмазков берут бактериологической петлей, открывая чашку в зоне пламени (в диаметре 2–7 см).

4.2.Оставшиеся на петле после приготовления препарата клетки микроорганизмов тщательно сжигают в пламени горелки. Прокаливание петли начинают с участка проволоки, примыкающего к кольцу, для того чтобы микробная масса, оставшаяся в петле, подсохла. Затем петлю переводят в вертикальное положение и прокаливают докрасна. Такой порядок стерилизации петли необходим потому, что при быстром нагревании влажной микробной массы происходит ее разбрызгивание и образуется аэрозоль, загрязняющий воздух. Только после прокаливания петлю можно положить на место.

4.3.Чашки Петри и пробирки с культурами нельзя оставлять открытыми, чтобы не допустить распыления микроорганизмов в лаборатории.

5. После окончания работы привести рабочее место в порядок, протереть иммерсионный объектив микроскопа бензином, тщательно вымыть руки.

37

Приложение 2

Приготовление бактериальных

препаратов­мазков

1.Для приготовления препарата-мазка используют предметное стекло, которое должно быть обезжиренным. Чтобы обезжирить стекло, одну из его поверхностей натирают кусочком сухого мыла, а затем удаляют его следы фильтровальной бумагой или сухой ватой.

2.На обезжиренную поверхность стекла наносят маленькую каплю дистиллированной воды.

3.Небольшое количество культуры, выросшей на поверхности твердой питательной среды, отбирают при помощи бактериологической петли с соблюдением правил стерильности и равномерно эмульгируют в капле воды. Приготовленные мазки высушивают на воздухе при комнатной температуре или в термостате.

4.После полного высыхания мазки фиксируют в пламени горелки с целью закрепления на стекле и лучшего окрашивания клеток. Для этого стекло берут пинцетом и проводят через верхнюю часть пламени два – три раза (около 2-х секунд).

5.При простом методе окраски на фиксированный препарат помещают несколько капель красящего раствора так, чтобы покрыть всю поверхность мазка. Красным красителем красят 1– 3 минуты, а синим 3–5 минут. Затем краску смывают дистиллированной водой, а мазок просушивают между полосками фильтровальной бумаги или на воздухе и микроскопируют с помощью иммерсионной системы. При окраске бактерий по Граму используют технику окрашивания, изложенную в прил. 3.

38

Приложение 3

Окраска бактерий по Граму

Если фиксированные клетки микроорганизмов обработать сначала кристаллическим фиолетовым, а затем йодом, на поверхности клеток образуется окрашенный комплекс. При последующей обработке спиртом в зависимости от строения клеточной стенки судьба комплекса будет различна: у так называемых грамположительных видов (Гр+) этот комплекс удерживается клеткой, и они остаются окрашенными, у грамотрицательных видов (Гр–) окрашенный комплекс вымывается из клеток, и они обесцвечиваются. При докрашивании фуксином Гр+ бактерии имеют синефиолетовый цвет, Гр– – красный цвет фуксина.

Техника окрашивания

1.Готовят бактериальный препарат-мазок, включая стадию фиксирования (прил. 2, п. 1–3).

2.Фиксированный препарат красят через полоску фильтровальной бумаги 2 мин карболовым генцианвиолетом.

3.Снимают бумагу и, не промывая водой, 1 мин протравливают мазок раствором Люголя.

4.Сливают раствор Люголя и на 30 с наносят на препарат спирт с йодом (2 мл 10%-го раствора йода на 100 мл этанола). Обработка спиртом производится до прекращения отхождения лиловых струек.

5.Быстро промывают мазок водой. Высушивают между полосками фильтровальной бумаги.

6.Докрашивают мазок фуксином 2 мин через фильтровальную бумагу.

7.Смывают краску водой, сушат между полосками фильтровальной бумаги и микроскопируют с помощью иммерсионной системы.

39

Приложение 4

Определение подвижности бактерий

Подвижность бактерий можно определить в препарате «висячая капля». Следует отличать движение клеток от их пассивного перемещения в результате броуновского движения, которое особенно заметно в суспензиях с большой плотностью. Способность к движению у большинства микроорганизмов обусловлена наличием жгутиков. От их расположения и количества зависит характер движения бактерий. Если жгутики расположены на одном или на двух полюсах клетки, то движение обычно очень быстрое – «ввинчивающееся», без покачивания из стороны в сторону; при латеральном или перитрихиальном расположении жгутиков клетки двигаются плавно, совершая колебательные отклонения от оси движения.

Приготовление препарата «висячая капля»

Каплю суспензии микроорганизмов петлей наносят на покровное стекло, поворачивают его каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением (лункой) в центре. Капля должна свободно висеть, не касаясь краев и дна лунки (рис. 8). Края лунки предварительно смазывают вазелином. Капля оказывается герметизированной во влажной камере, что делает возможным многодневное наблюдение за объектом.

40