Материал: Биоиндикация. Микробиологические методы исследования экосистем (90
Индикатором воздушно-капельного загрязнения объектов окружающей среды является золотистый стафилококк – Staphylococcus aureus, который относится к факультативным, но очень часто обнаруживаемым обитателям организма человека и некоторых теплокровных животных. Основным местом его локализации в организме человека служат слизистые оболочки верхних дыхательных путей. Для его обнаружения проводят посев отобранной пробы на дифференциально-диагностическую среду ЖСА – желточносолевой агар.
Индикатором фекального загрязнения являются бактерии группы кишечных палочек (БГКП) или, в соответствии с международной номенклатурой, колиформные бактерии (Coliformes – ФАО/ВОЗ и СЭВ). Среди колиформных бактерий различают об-
щие колиформные бактерии (ОКБ) и термотолерантные коли-
формные бактерии (ТКБ) [3]. ТКБ иначе еще называют фекальными кишечными палочками (ФКП). К этой группе относится Escherichia coli – типичный обитатель кишечника человека и теплокровных животных. Именно ее присутствие в объектах окружающей среды служит показателем свежего фекального загрязнения. Дифференциально-диагностической средой для обнаружения E. coli является среда КОДА с лактозой. Среда ингибирует рост стафилококка и протея.
Индикатором загрязнения объектов окружающей среды разлагающимися органическими веществами является Proteus vulgaris. Обнаружение большого количества бактерий вида P. vulgaris в объектах внешней среды свидетельствует о развитии в них гнилостных процессов. Для обнаружения протея используют среду МПА, при этом видовое определение не проводят.
Посев на среду ЖСА
Посев проводят в чашки Петри, которые заранее заливают средой ЖСА. Палочку с влажным ватным тампоном извлекают из пробирки со смывом и проводят посев штрихом, совершая зигзагообразные движения тампоном по поверхности среды ЖСА. Чашки с посевами выдерживают в термостате при 37оС в течение двух суток.
31
Посев на среду КОДА
Посев проводят в пробирки с 10 мл среды КОДА. Для этого ватный тампон, с помощью которого производили смыв, сбрасывают с палочки, на которой он крепился, в пробирку со средой КОДА так, чтобы тампон оказался полностью погруженным в среду. Пробирку закрывают ватно-марлевой пробкой и выдерживают в термостате при 43оС в течение суток.
Посев на среду МПА
Присутствие протея определяют по методу Шукевича, посев проводят в пробирки со скошенной средой МПА. Для этого 0,1 мл жидкости смыва вносят в конденсационную воду скошенного МПА. Конденсационной водой называется вода, которая скапливается в пробирке в нижней части скошенной питательной среды. Следует работать очень аккуратно, чтобы посевной материал не попал на поверхность среды. Пробирки инкубируют в термостате при 37оС в течение суток.
3.1.3. Анализ посевов
При анализе посевов все особенности роста обнаруженных санитарно-показательных микроорганизмов фиксируют в рабочем журнале, заполняя таблицу 8.
Таблица 8
Характеристика санитарно-показательных микроорганизмов
Объ- |
Сани- |
Диффе- |
Нали- |
Макроскопиче- |
Микроскопическая |
||||
ект |
тарно- |
ренци- |
чие |
ская картина |
|
картина |
|
||
иссле- |
показа- |
ально- |
роста |
|
|
|
|
|
|
дова- |
тельные |
диагно- |
|
|
|
|
|
|
|
ния |
микро- |
стиче- |
|
|
|
|
|
|
|
|
организ- |
ская |
|
|
|
|
|
|
|
|
мы |
среда |
|
|
|
|
|
|
|
|
1. |
|
«+» |
Рисунок карти- |
Рисунок поля |
зрения |
|||
|
|
|
или |
ны |
роста |
и |
микроскопа и |
описа- |
|
|
|
|
«-» |
описание |
ха- |
ние свойств бактери- |
|||
|
|
|
|
рактера роста |
альных клеток: |
|
|||
|
|
|
|
на |
дифферен- |
1) |
морфология; |
|
|
|
|
|
|
циально- |
|
2) |
окраска по Граму; |
||
|
|
|
|
диагностиче- |
3) |
наличие спор; |
|||
|
|
|
|
ской среде |
|
4) |
подвижность. |
||
|
2. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
3. |
|
|
|
|
|
|
|
|
32
Обнаружение золотистого стафилококка –
Staphylococcus aureus
Проводят просмотр чашек, засеянных на предыдущем занятии. На ЖСА золотистый стафилококк, выделенный от человека, растет в виде круглых блестящих колоний золотистого цвета, вокруг которых в 60–70% случаев образуется радужный венчик и зона помутнения среды. Одну из таких колоний микроскопируют. Для этого готовят мазок, который окрашивают по Граму (прил. 3). Под микроскопом клетки S. aureus имеют вид грамположительных кокков, располагающихся неправильными гроздьями и не образующих спор и капсул (рис. 6, А).
А |
Б |
В |
Рис. 6. Вид клеток под микроскопом:
А – Staphylococcus aureus; Б – Escherichia coli; В – Proteus vulgaris
Остальные колонии, которые по морфологическим признакам отличаются от типичных для S. aureus, подлежат дальнейшему изучению по схеме (рис. 7).
Обнаружение кишечной палочки – Escherichia coli
Просматривают пробирки с посевами на среде КОДА. Отсутствие изменений в посевах позволяет уже на этом этапе закончить исследование и дать отрицательный ответ о присутствии E. сoli. При изменении цвета среды КОДА с первоначального темно-зеленого на ярко-желтый, сопровождающемся газообразованием и помутнением, делают вывод о присутствии E. сoli. Микроскопический анализ при этом, как правило, не проводят. Помутнение среды без изменения цвета указывает на рост сальмонелл, шигелл, некоторых энтеропатогенных эшерихий, не разлагающих лактозу. Такие пробы должны быть подвергнуты дальнейшему бактериологическому исследованию.
33
Рис. 7. Идентификация культуры
на принадлежность к Staphylococcus aureus:
(-) культуры отбрасываются
Обнаружение бактерий группы протея – р. Proteus
Характерной культуральной особенностью бактерий этого рода является способность к роению, обусловленная их подвижностью: на твердых питательных средах они образуют вуалеобразный рост, постепенно закрывая всю поверхность среды. В связи с этим при наличии протея в исследуемом объекте в посевах наблюдается ползучий рост по поверхности скошенного МПА.
Просматривают пробирки с посевами, отмечая характер роста бактерий на среде МПА. Затем проводят микроскопический анализ посева. Для этого с верхнего края выросшей культуры 1) готовят мазок, который окрашивают по Граму (прил. 3); 2) готовят препарат «висячая капля» для определения подвижности бактерий (прил. 4). По морфологии бактерии р. Proteus – это грамотрицательные подвижные палочки с перитрихальными жгу-
34
тиками, с присущим проявлением полиморфизма10 в зависимости от условий, спор и капсул не образуют (рис. 6, В).
3.1.4.Оценка санитарно-гигиенического состояния исследуемого объекта
Проведенные исследования позволяют дать качественную характеристику обсемененности обследованных объектов сани- тарно-показательными микроорганизмами. Основываясь на полученных результатах, делают заключение о видах бактериального загрязнения обследованного объекта в зависимости от присутствия тех или иных групп санитарно-показательных микроорганизмов и дают предварительную оценку его санитарногигиенического состояния.
При оценке результатов микробиологического обследования некоторых объектов можно ориентироваться на следующие нормативы:
−на предприятиях общественного питания на оборудовании, не соприкасающемся с сырыми продуктами, и вымытой посуде рассматриваемые санитарно-показательные микроорганизмы должны отсутствовать;
−в лечебных учреждениях допускается присутствие E. сoli в 5% проб; обнаружение золотистого стафилококка свидетельствует о санитарном неблагополучии [4].
Если требуется выявить степень бактериальной обсемененности объекта, то проводят количественное определение сани- тарно-показательных микроорганизмов. Для этого поступают следующим образом.
При использовании метода смывов сначала доводят общий объем жидкости в пробирке с ватным тампоном до 10 мл стерильной дистиллированной водой и получают таким образом условное исходное разведение 1:10. Из этого разведения готовят серию последовательных десятикратных разведений (рис. 1) с последующим высевом по 1 мл из каждого разведения на указанные выше среды. После инкубации отмечают то наибольшее разведе-
10 Способность бактерий изменять свою форму и послужила основанием для названия рода. Мифический бог Протей – бог, способный менять свой облик.
35