АВТОРЕФЕРАТ
Информативность методов диагностики урогенитального трихомониаза и обоснование показаний к применению ПЦР в реальном времени
03.02.03 - микробиология
14.01.10 - кожные и венерические болезни
Мустафина Гульгена
Уфа - 2010
Работа выполнена на кафедре лабораторной диагностики Института последипломного образования и кафедре дерматовенерологии в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Научные руководители:
доктор медицинских наук, профессор Мавзютов Айрат Радикович
доктор медицинских наук, профессор Хисматуллина Зарема Римовна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Ворошилова Наталья Николаевна
доктор медицинских наук, профессор Чеботарев Вячеслав Владимирович
Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Урогенитальный трихомониаз широко распространен в мире и повсеместно занимает одно из первых мест в структуре инфекций, передаваемых половым путем (ИППП) [Дмитриев Г.А., 2005, Теличко И.Н., 2007, Schwebkehttp://jcm.asm.org/cgi/content/full/40/10/3681 - COR1 J.R. et al., 2006, Shafir S.C. et al., 2009]. В последние годы отмечаются определенные позитивные тенденции в динамике заболеваемости манифестными формами трихомониаза. Указанное, однако, сопровождается увеличением количества своевременно не выявленных субманифестных и, в особенности, бессимптомных вариантов этой патологии. По некоторым данным их удельный вес достигает 40-50% от общего числа больных трихомониазом [Рюмин Д.В., 2009 и др.]. В этой связи, очевидно, что истинная ситуация, учитывающая все формы урогенитального трихомониаза, может характеризоваться и негативной направленностью.
Социальным последствием указанного является существенное ухудшение репродуктивного здоровья населения, что в последние годы рассматривается в качестве угрозы национальной безопасности России и послужило в соответствии с Постановлением Правительства РФ №715 от 01.12.2004г. основанием для отнесения трихомониаза к разряду социально значимых заболеваний. Всемирная организация здравоохранения 18 мая 2006г. на 59-ой сессии Всемирной ассамблеи здравоохранения в отношении ИППП утвердила глобальную стратегию на 2005-2015гг. «Предотвращение и контроль инфекций, передаваемых половым путем», в связи с чем совершенствование диагностики урогенитального трихомониаза было обозначено в качестве одной из первостепенных задач дерматовенерологии. Вместе с тем клиническая дифференцировка указанного заболевания достаточно проблематична, поскольку симптоматика лишена специфики и может иметь место и при других инфекций передаваемых половым путем [Рюмин Д.В., 2009 и др.]. Диагностика трихомониаза существенно осложнилась в последние годы в связи распространенностью атипичных вариантов Trichomonas vaginalis [Дмитриев Г.А., 2003, Schwebkehttp://jcm.asm.org/cgi/content/full/40/10/3681 - COR1 J.R. et al., 2006], наиболее часто выявляемых у мужчин [Иванов АМ., 2005 и др.], учет которых в соответствии с приказом МЗ СССР №1570 от 04.12.1986г. не осуществляется должным образом.
Все вышеперечисленное в значительной степени снижает информативность, особенно у мужчин, традиционно применяемых методов микроскопии и культурального исследования [Марданлы С.Г. и др., 2007] и предполагает разработку новых, более совершенных методов лабораторной диагностики трихомониаза. Среди последних в качестве наиболее перспективных, как было показано на модели других инфекций урогенитального тракта, рассматриваются амплификационные методы, в частности, полимеразная цепная реакция (ПЦР) [Caliendo A.M. et al., 2005]. Однако имеющиеся литературные данные относительно диагностики урогенитального трихомониаза этим методом крайне противоречивы [Дмитриев Г.А., 2003, Теличко И.Н. и др., 2006, Марданлы С.Г. и др., 2007, Caliendo A.M. et al., 2005, Mckechnie M.L. et al., 2009]. Указанное предопределило необходимость систематизации имеющихся данных и разработку четких клинико-лабораторных критериев для применения ПЦР в диагностике трихомониаза с учетом специфики преаналитического, аналитического и, безусловно, постаналитического этапов.
Цель исследования
Провести сравнительную оценку эффективности методов лабораторной диагностики трихомониаза у мужчин, установить информативность современных молекулярно-генетических диагностических технологий и обосновать показания к их практическому применению.
Задачи исследования
1 На основе клинико-эпидемиологических и социально-гигиенических признаков обосновать выделение группы обследуемых пациентов с урогенитальным трихомониазом, адекватной для оценки эффективности диагностических лабораторных тестов.
2 Провести сравнительный анализ информативности используемых в настоящее время методов лабораторной диагностики трихомонадной инфекции.
3 Оптимизировать культуральный метод для сокращения сроков идентификации Trichomonas vaginalis.
4 На основе анализа банка генов подобрать и апробировать праймеры для детекции Trichomonas vaginalis методом классической полимеразной цепной реакции и полимеразной цепной реакции в реальном времени.
5 Обосновать применение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени при диагностике урогенитального трихомониаза.
Научная новизна исследования
В результате проведенных исследований создана модификация питательной среды, позволяющая сократить сроки детекции Trichomonas vaginalis культуральным методом до 2 суток. Впервые в отечественных тест-системах подобраны и апробированы праймеры к гену 18S рРНК T.vaginalis. Данные праймеры могут быть использованы как для ПЦР в классическом варианте, так и ПЦР в реальном времени. Праймеры к гену 18S рРНК позволили повысить вероятность обнаружения Trichomonas vaginalis методом полимеразной цепной реакции. Показаны преимущества применение ПЦР в режиме реального времени для диагностики урогенитального трихомониаза, обусловленные высокой чувствительностью, возможностью количественного определения специфических фрагментов ДНК Trichomonas vaginalis в исследуемом материале.
Научно-практическая значимость работы
Разработан алгоритм лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза, включающий полимеразную цепную реакцию у мужчин. Предложена модификация состава питательной среды для культурального исследования клинического материала и сконструированы праймеры для полимеразной цепной реакции, что позволило повысить эффективность лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза у больных.
Основные положения, выносимые на защиту:
1 Для оценки эффективности диагностических тестов по клинико-эпидемиологическим проявлениям адекватной является группа больных с урогенитальным трихомониазом являются мужского пола в возрасте 20-29 лет, имеющих высокую частоту случайных половых связей (70,0%), злоупотребляющих алкоголем (82,7%), часто пользующихся практикой незащищенного секса (55,5%).
2 Включение комплекса железа [III] гидроксид полиизомальтозат в состав питательной среды для культивирования Trichomonas vaginalis позволяет сократить сроки диагностики урогенитального трихомониаза культуральным методом.
3 Преимуществом классической полимеразной цепной реакции в сравнении с микроскопическим и культуальным методами диагностики урогенитального трихомониаза является выявление различных форм заболевания вне зависимости от выраженности у обследуемых пациентов воспалительного процесса, характера течения и длительности заболевания.
4 Использование полимеразной цепной реакции по конечной точке с праймерами TrVa 22 (5?TCC ACA GTA CCA AAA GGC ACC AAT G3?), TrVa 11 (5?TCA TCA GAG GCA CGC CAT TCG A3?) к гену 18S рибосомальной РНК Trichomonas vaginalis является высокоспецифичным тестом в диагностике урогенитального трихомониаза. Применение количественного варианта ПЦР в реальном времени с праймерами TrVa 22 (5?TCC ACA GTA CCA AAA GGC ACC AAT G3?), TrVa 11 (5?TCA TCA GAG GCA CGC CAT TCG A3?) к гену 18S рибосомальной РНК Trichomonas vaginalis позволяет определить минимальное количество возбудителя в клиническом материале.
Апробация
Материалы диссертации представлены на международных, всероссийских, региональных научно-практических конференциях (всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Полевые и экспериментальные исследования биологических систем» (Ишим, 2009); IV международном конгрессе, посвященном современным аспектам вспомогательных репродуктивных технологий «Актуальные вопросы вспомогательных репродуктивных технологий (проблемы и решения)» (Москва, 2007); I региональном научном форуме «Мать и дитя» (Казань, 2007); IX съезде всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); IX всероссийской конференции дерматовенерологов (Екатеринбург, 2006).
Личный вклад автора
Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической и клинико-микробиологической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрения в практику.
Внедрение результатов исследования в практику
Полученные в настоящем исследовании результаты внедрены и используются в научно-педагогической и лечебно-диагностической работе кафедры дерматовенерологии ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», инфекционных болезней с курсом дерматовенерологии ИПО и лабораторной диагностики ИПО ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», ГУЗ «Республиканский кожно-венерологический диспансер» Республики Башкортостан.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 2 - в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, приложения. Работа изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит 35 таблиц, 25 рисунков, 1 приложение. Список литературы включает 177 источников (64 отечественных и 113 зарубежных авторов).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Динамика заболеваемости урогенитальным трихомониазом за 1991-2008 гг. оценивалась нами по данным Государственного учреждения здравоохранения «Республиканский кожно-венерологический диспансер» Республики Башкортостан.
Социально-гигиеническая характеристика 466 больных урогенитальным трихомониазом (225 женщин и 241 мужчина) осуществлялась через анонимное анкетирование с использованием разработанной нами анкетой.
Объектом исследования явился 361 пациент, из которых 253 больных урогенитальным трихомониазом составили основную группу, а 108 мужчин - группу контроля. Набор больных в группы сравнения проводился в соответствии с целью исследования. Включение в группы наблюдения обеспечивалось информированным согласием больных на проведение лечебно-диагностических процедур, выполнением пациентами указаний врача относительно назначенного обследования и терапии, а также воздержанием от незащищенных половых контактов на время исследования. Обязательными условиями исключения из групп наблюдения были тяжелые сопутствующие заболевания (онкологические болезни, системные заболевания), сифилис. Обнаружение N.gonorrhoeae, C.trachomatis, M.hominis, U.urealyticum, Candida не являлось основанием для исключения из групп наблюдения. Регистрировали общие сведения о больных, жалобы на момент поступления, данные урологического анамнеза, объективного осмотра, результаты клинико-лабораторных исследований. Все исследования проводили в соответствии с действующей нормативной документацией: приказами Минздрава России № 1570 от 04.12.1986 г., № 286 от 07.12.1993 г., № 64 от 21.02.2000 г., № 173 от 28.02.2005 г., протоколом ведения больных «Урогенитальный трихомониаз» (утв. МИНЗДРАВСОЦРАЗВИТИЯ РФ 14.01.2005).
Материал для микроскопического, культурального, молекулярно-генетического исследования получали из уретры мужчин с урогенитальным трихомониазом. Перед забором биологического материала пациент воздерживался от мочеиспускания в течение 4-6 часов. У мужчин непосредственно перед взятием материала наружное отверстие уретры обрабатывали марлевым тампоном. При отсутствии выделений проводили массаж уретры с помощью зонда для взятия материала. Затем универсальный зонд вводили в уретру на 3-4см и делали соскоб. Для метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) отделяемое из мочеиспускательного канала переносили в пробирку («ЕРРЕNДОRF», Германия) c транспортной средой, содержащей фосфатный буфер, для микроскопии - на предметные стекла и культурального исследования - в пробирки с питательной средой (приказ Минздрава СССР № 936 от 12.07.85 г).
Визуально T.vaginalis обнаруживали бактериоскопическим методом при исследовании окрашенных по Граму микропрепаратов отделяемого из уретры.
Ультраструктурные особенности T.vaginalis исследовали с использованием электронной микроскопии (на базе ЦНИКВИ, г.Москва). Для этого готовили фиксированные в 4% растворе глютаральдегида на 0,1 М кокадилатном буфере (рН 7,2 - 7,4) препараты T.vaginalis [Абдумаликов Р.А., 1985], выделенных от больных с хронической формой заболевания. Накопление культур осуществляли инкубированием полученных клеток простейших в течение 3-х суток. Исследование ультраструктуры T.vaginalis проводили методом ультратонких срезов с последующим изучением на электронном микроскопе (JEM100S, Япония).
Для культурального исследования T.vaginalis применяли жидкую питательную среду (ООО НПФ «Диагност-мед», г.Омск). Инкубацию посевов проводили при температуре 37oC в течение 3-6 дней. Подсчет клеток T.vaginalis проводили с использованием камеры Горяева. ПЦР использовали для верификации результатов микроскопии и культурального исследования при выявлении T.vaginalis с применением сертифицированного комплекта реагентов для ПЦР с детекцией методом электрофореза («ДНК-Технология», Россия). Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей, подбор праймеров проводили с помощью пакета компьютерных программ Lasergene (DNASTAR Inc., США), Oligo 4.1 (National Biosciences Inc., США).
Для детекции грибов Candida в отделяемом из уретры использовали микроскопию (окраска по Граму), культуральный метод (среда Сабуро). Для лабораторной детекции Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum использовали ПЦР («ДНК-Технология», Россия), иммуноферментный метод (ЗАО «Вектор-Бест», Россия), Neisseria gonorrhoeae - бактериоскопический, культуральный метод, ПЦР («ДНК-Технология», Россия). Иммуноферментные исследования проводились для оценки этиологической значимости M.hominis, U.urealyticum с помощью тест-системы (ЗАО «Вектор-Бест», Россия).