С использованием данных банка-генов нами были сопоставлены последовательности генов 18SрРНК Dientamoeba fragilis, Pentatrichomonas hominis (abdominalis), T.tenax (elongata), T.vaginalis для конструирования специфичных праймеров, применимых при детекции T.vaginalis методом ПЦР в мазках и другом клиническом материале. В результате проведенных исследований и серий испытаний была определена соответствующая пара праймеров, специфичных к гену 18S pРНК T.vaginalis: TrVa 22 (5?TCC ACA GTA CCA AAA GGC ACC AAT G3?), TrVa 11 (5?TCA TCA GAG GCA CGC CAT TCG A3?).
Наряду с геном 18S pРНК, наиболее исследованным, по данным литературы, является ген бета-тубулина T.vaginalis [Hardick J. et al, 2003]. Согласно данным литературы, ПЦР с праймерами BTUB9 и BTUB2 обеспечивает чувствительность равную 98%, в сравнении с культуральным методом системы InPouch, имеющую чувствительность равную 70% [Hardick J. et al, 2003]. В этой связи для оценки информативности нашей разработки нами наряду с праймерами к гену 18S pРНК были синтезированы и использованы праймеры к гену бета-тубулина T.vaginalis - BTUB9 (5'CA TTG ATA ACG AAG CTC TTT ACG AT3') и BTUB2 (5'GC ATG TTG TGC CGG ACA TAA CCAT3') (фирма SYNTOL, г. Москва).
Сравнительное исследование диагностических возможностей ПЦР по выявлению T.vaginalis показало, что чувствительность «классической» ПЦР была выше для праймеров TrVa11 и TrVa22 (к гену 18S рРНК T.vaginalis) (100%), чем для BTUB9 и BTUB2 (к гену бета-тубулина T.vaginalis) (83,9%) (p=0,023).
Параллельно с ПЦР, основанной на электрофоретической детекции, нами была осуществлена адаптация ПЦР для варианта “real-time” с праймерами BTUB9 x BTUB2 и TrVa11 x TrVa22 и применением интеркалирующего агента SYBR Green I.
При проведении ПЦР в реальном времени с праймерами BTUB9xBTUB2 кривые плавления ампликонов характеризовались наличием двух пиков (рис.3). Принадлежность каждого из пиков к определенной группе (T.vaginalis и неспецифическим продуктам) была установлена путем сравнения пиков плавления, при этом основной продукт амплификации плавился при температуре 85°C, а неспецифический продукт (димеры) - 78,5°C. Постамплификационный анализ кривых плавления ПЦР - фрагментов позволил провести дифференциацию полученных ампликонов за счет различий в температурах плавления.
При проведении ПЦР в реальном времени с праймерами TrVa11 и TrVa22 кривые плавления ампликонов характеризовались наличием одного пика, что свидетельствовало о высокой степени их гомологии, при этом в контроле и в образце с человеческой ДНК соответствующие пики не наблюдались, что доказывает высокую специфичность праймеров.
Рис. 3. Кривые плавления ампликонов после проведения ПЦР с праймерами BTUB9 x BTUB2. Ось ординат - флюоресценция (нм), ось абсцисс - температура плавления (°С).
Количественный анализ содержания T.vaginalis в образце был проведен нами посредством метода ПЦР в реальном времени с праймерами BTUB9 и BTUB2, TrVa11 и TrVa22. Полученные данные позволили получить более достоверную информацию об исходной концентрации клеток T.vaginalis в образцах, полученных от больных. После 45 циклов ПЦР по конечной точке с праймерами BTUB9 и BTUB2, TrVa 11 и TrVa22 при анализе результатов электрофоретического фракционирования по выраженности свечения обеспечивались лишь полуколичественные данные. ПЦР в реальном времени с праймерами BTUB9 и BTUB2, TrVa11 и TrVa22 позволила определить более четкие количественные различия в концентрации исходной матрицы в образцах. По индивидуальным для каждого образца графикам амплификации мы определяли количественные различия по содержанию исходной матрицы (генов 18S рРНК и бета-тубулина). Концентрации матрицы гена 18S рРНК в образцах отличались почти на один - три порядка (каждые 3.3 цикла различия в выходе кривой на логарифмическую стадию характеризовались 10 - кратной разницей концентрации матриц), а для некоторых образцов вход в логарифмическую фазу происходил на 19 и 32 циклах соответственно, при этом разница в 13 циклов давала различия в исходных концентрациях матриц почти на 4 порядка, то есть в 10 000 раз. Согласно нашим исследованиям, количественные различия между образцами с T.vaginalis по содержанию исходной матрицы гена бета-тубулина были незначительными. Так, разница количеств амплифицированных ДНК генов бета-тубулина T.vaginalis между образцами при выходе в логарифмическую фазу составила всего 6 циклов (27 и 33), то есть менее чем на два порядка (102). Указанные различия количеств амплифицированной ДНК, возможно, объяснялись невысокой эффективностью ПЦР с праймерами к гену бета-тубулина при низких исходных концентрациях матрицы, что свойственно тест-системам, предназначенным для детекции уникальных или слабоповторенных генов, присутствующих в единичных копиях в геномах выявляемых патогенов.
Чувствительность ПЦР в реальном времени с использованием праймеров TrVa11 и TrVa22 (100%) была сопоставима с чувствительностью классического варианта ПЦР с указанными праймерами. При использовании праймеров BTUB9 и BTUB2 чувствительность ПЦР в реальном времени составляла 90,3%, что было выше, чем у «классической» ПЦР с этими же праймерами (83,9%) (p>0,05). Вместе с тем, ПЦР в реальном времени с использованием праймеров TrVa11 и TrVa22 была более чувствительной, нежели с праймерами BTUB9 и BTUB2, в связи с большим содержанием копий гена 18S рРНК в T.vaginalis и меньшим исходным количеством копий гена бета-тубулина.
Таким образом, в связи большей копийностью гена 18S рРНК в клетках T.vaginalis, вероятность обнаружения возбудителя при использовании праймеров к данному гену, существенно возрастает. Использование праймеров TrVa11 и TrVa22 позволяет проводить детекцию T.vaginalis в течение одного рабочего дня не только в «классическом» варианте, но и при проведении ПЦР в реальном времени. При ПЦР в реальном времени использование праймеров TrVa11 и TrVa22 позволяет сократить время проведения анализа, а также проводить количественное определение T.vaginalis в биоматериале, полученном от больного. Применение ПЦР в режиме реального времени с праймерами к гену 18S рибосомальной РНК Trichomonas vaginalis позволяет определить минимальное количество возбудителя в клиническом материале. Данная методика практически полностью исключает загрязнение ампликонами рабочих помещений, таким образом, снижает риск получения ложнопозитивных результатов к абсолютному минимуму, что при использовании «классической» ПЦР удается не всегда.
ВЫВОДЫ
1 Наиболее адекватную группу пациентов с урогенитальным трихомониазом для оценки эффективности диагностических тестов по клинико-эпидемиологическим проявлениям в моно- и микствариантах составляют мужчины в возрасте 20-29 лет, имеющие высокую частоту случайных половых связей (70,0%), злоупотребляющие алкоголем (82,7%), часто пользующиеся практикой незащищенного секса (55,5%).
2 Сокращение сроков культуральной детекции и идентификации Trichomonas vaginalis до 2 суток достигается внесением к 5 мл питательной среды 0,03г (0,06 мл) комплекса железа [III] гидроксид полиизомальтозат в виде жидкого лекарственного средства Феррум лек (LEK Pharmaceuticals, Словения).
3 Классическая полимеразная цепная реакция при диагностике урогенитального трихомониаза отличается высокой чувствительностью и специфичностью не зависимо от выраженности и локализации воспалительного процесса, длительности течения заболевания.
4 Сконструированные праймеры TrVa 22 (5?TCC ACA GTA CCA AAA GGC ACC AAT G3?), TrVa 11 (5?TCA TCA GAG GCA CGC CAT TCG A3?) к 18S рРНК обеспечивают высокоспецифичную детекцию Trichomonas vaginalis в клиническом материале без образования димеров и перекрестных реакций с человеческой ДНК как в качественном варианте полимеразной цепной реакции, так и при проведении ее в режиме реального времени.
5 Real-time ПЦР с праймерами TrVa 22/TrVa 11 к консервативному видоспецифичному фрагменту 18S рибосомальной РНК Trichomonas vaginalis обеспечивает высокую чувствительность и специфичность исследования, возможность получения количественных данных и их автоматическую регистрацию, что существенно оптимизирует лабораторную диагностику урогенитального трихомониаза.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1 При диагностике урогенитального трихомониаза у мужчин культуральным методом рекомендуется использовать модифицированную среду, содержащую в 5мл 0,03г комплекса железа [III] гидроксид полиизомальтозат (0,06 мл жидкого лекарственного средства Феррум лек, LEK Pharmaceuticals, Словения).
2 Для повышения качества лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза рекомендуется использовать полимеразную цепную реакцию с праймерами TrVa 22 (5?TCC ACA GTA CCA AAA GGC ACC AAT G3?), TrVa 11 (5?TCA TCA GAG GCA CGC CAT TCG A3?) к гену 18S рибосомальной РНК Trichomonas vaginalis.
3 При диагностике различных форм урогенитального трихомониаза у мужчин рекомендуется использование полимеразной цепной реакции для исследования отделяемого из уретры, обладающей высокой чувствительностью и специфичностью не зависимо от локализации, длительности и выраженности воспалительного процесса.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1 Мустафина Г.Р., Мавзютов А.Р., Хисматуллина З.Р., Ибраева Р.А. Ретроспективный анализ распространенности урогенитального трихомониаза среди женщин// Мать и дитя: матер. всероссийского форума. - М., 2006. - С. 649.
2 Мустафина Г.Р., Мавзютов А.Р., Хисматуллина З.Р. Социально-гигиеническая характеристика больных урогенитальным трихомониазом// Вестник перинаталогии, акушерства и гинекологии. - Красноярск, 2006. - №13.- С. 428-430.
3 Мустафина Г.Р., Ибраева Р.А. Актуальность выявления анаэробной микрофлоры, ассоциированной с урогенитальным трихомониазом /Актуальные вопросы инфекционной патологии в клинической практике. - Уфа, 2006.- С.173-174.
4 Мустафина Г.Р., Мавзютов А.Р., Хисматуллина З.Р., Ибраева Р.А. Анализ ошибок в диагностике хронического урогенитального трихомониаза// Фундаментальные исследования в биологии и медицине: сборник научных трудов. - Вып.1.-Ставрополь: Изд-во СГУ, 2006.- С.148-150.
5 Мустафина Г.Р., Мавзютов А.Р., Ибраева Р.А. Социально-гигиенические особенности урогенитальной трихомонадной инфекции на современном этапе// Актуальные вопросы инфекционной патологии в клинической практике. - Уфа, 2006. - С. 177-178.
6 Мустафина Г.Р., Никоноров Ю.М., Чемерис А.В., Мавзютов А.Р. Разработка и испытание «ПЦР в реальном времени» для детекции Trichomonas vaginalis в клиническом материале// Матер. IX съезда всероссиско-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - Москва, 2007. - Т. 3. - С. 67-68.
7 Мустафина Г.Р., Никоноров Ю.М., Зиганшина С.Р., Чемерис А.В., Мавзютов А.Р. Использование полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) для детекции Trichomonas vaginalis в клиническом материале// Биомика - наука XXI века. Матер. школы-семинара молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии. - Уфа, 2007. - С.99-100.
8 Мустафина Г.Р., Никоноров Ю.М., Чемерис А.В., Мавзютов А.Р., Хисматуллина З.Р. Возможности и перспективы метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике урогенитального трихомоноза// Клиническая лабораторная диагностика. - 2008. - №9. - С. 45.
9 Мустафина Г.Р., Хисматуллина З.Р., Мавзютов А.Р., Шакирова Г.Р. Способ выделения Trichomonas vaginalis// Пермский медицинский журнал. - 2008. - Т.25. - №5. - С. 61-64.
10 Мустафина Г.Р., Хисматуллина З.Р., Мавзютов А.Р., Шакирова Г.Р. Современные аспекты гипердиагностики урогенитального трихомониаза// Сибирский журнал дерматологии и венерологии. - 2009. - Т. II. - №.10 - С.134-135.
11 Белоусова Н., Мустафина Г.Р., Никоноров Ю.М. Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) для мониторинга трихомониазной инфекции/ Полевые и экспериментальные исследования биологических систем: матер. всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых. - Ишим, 2009. - С.116.
12 Hismatullina Z.R., Sigajev N.I., Mustafina G.R., Sakirova G.R. Eraroj en diagnozado de urogenitala trihomoniaso. Medicina internacia revuo. - Junio 2009.-Vol. 23a. - №3 (92). - P. 86-87.