Автореферат: Информативность методов диагностики урогенитального трихомониаза и обоснование показаний к применению ПЦР в реальном времени

Статистический анализ полученных данных проводили с помощью пакета прикладных программ, а также формул А.Е. Платонова (2000), О.Ю. Ребровой (2003). Статистические гипотезы считались подтвержденными при уровне значимости р<0,05. В случае нормального распределения данных вычисляли среднюю арифметическую (М), стандартное отклонение (у, Sd). Для сравнения долевых показателей (%) использовали критерий - угловое преобразование Фишера (tц). При малочисленности групп и неясности закона распределения величин вычисляли медиану (Ме) и интерквартильный размах (а₁-а₃), для сравнения двух независимых групп использовали непараметрический критерий Манна-Уитни (U). Использовался также метод двухфакторного дисперсионного анализа. Для сравнения качественных признаков (n>20) применяли метод Х². Для проверки гипотез использовали показатели, выдаваемые расчетными модулями программы. Чувствительность, специфичность, диагностическая эффективность, прогностическая ценность отрицательного и положительного результатов, разность рисков, коэффициент асимметрии результатов используемых лабораторных методов диагностики урогенитального трихомониаза рассчитывали с помощью четырехпольной таблицы Фишера [Платонов А.Е., 2000].

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Динамика заболеваемости урогенитальным трихомониазом среди мужского населения г.Уфы за наблюдаемые годы (1991-2008) характеризовалась различной направленностью линии тренда. С 1991 по 1999гг она имела выраженную неблагоприятную тенденцию. Указанное, очевидно, во многом было связано с началом существенных преобразований в обществе, значимой составляющей которых являлись поведенческие реакции среди сексуально-активной части населения. С 1999 года в динамике заболеваемости урогенитальным трихомониазом наметилась тенденция к снижению, что, по-видимому, было связано с обращением части больных в частнопрактикующие учреждения, самолечением в связи с широкой доступностью лекарственных средств и с одновременным увеличением частоты атипичных трудно - диагностируемых форм T.vaginalis. За наблюдаемые годы наиболее высокие уровни урогенитального трихомониаза отмечались у молодых мужчин 20-29 лет (рис.1). Уровень заболеваемости среди них статистически значимо превосходил значения в возрастных группах 18-19 и 30-39 лет. В период максимальной заболеваемости в 1999-2000гг (2425,2 ±36,5‰оо) ее интенсивность в этой группе более, чем в 3 раза, превосходила показатели 1991-1992 и 2005-2008 (728,7±21,7) и (670,1±13,7)‰оо, соответственно. В структуре заболевших на данную возрастную группу во все годы наблюдения приходилось около 60% от общего числа случаев заболевания урогенитальным трихомониазом.

По результатам проведенных нами социально-гигиенических исследований, среди опрашиваемых мужчин с урогенитальным трихомониазом доля молодых в возрасте 20-29 лет составила 45,6 процентов.

Рис. 1. Возрастная структура заболевших урогенитальным трихомониазом среди мужского населения г.Уфы по различным периодам наблюдений

При такой распространенности заболевания, согласно эпидемиологическим данным, диагностический тест с чувствительностью и специфичностью, равной 95% будет выявлять большинство инфицированных лиц [Флетчер Р., 1998]. Исследования данных анкетирования показали, что мужчин в возрасте 20-29 лет, больные урогенитальным трихомониазом в большинстве случаев имели высокую частоту случайных половых связей (70,0%), злоупотребляли алкоголем (82,7%), часто пользовались практикой незащищенного секса (55,5%).

На эффективность диагностических тестов в существенной мере влияет стадия и степень тяжести процесса. Исследования особенностей клинических проявлений урогенитального трихомониаза у мужчин выявило, что воспалительный процесс и тяжесть течения заболевания были выражены у больных 20-29 лет как при свежей, так и при хронической форме. При свежей трихомонадой инфекции в этой группе больных чаще были выражены такие клинические проявления, как выделения из половых путей (98,1%) и дискомфорт в уретре (66,1%). При хронической инфекции кроме вышеперечисленных признаков также часто отмечались дизурические расстройства (76,2%), ощущение жжения, зуда в области гениталий (23,8%), боли характерные для простатита (57,1%). Эти результаты позволили обосновать выделение в соответствии с принципами доказательной медицины группу пациентов с урогенитальным трихомониазом в возрасте 20-29 лет как адекватную для оценки эффективности диагностических тестов по чувствительности, специфичности и их прогностической ценности.

Следовательно, группа мужчин, больных урогенитальным трихомониазом в возрасте 20-29 лет является наиболее адекватной с эпидемиологической точки зрения моделью для оценки эффективности диагностических тестов по показателям чувствительности, специфичности и их прогностической ценности.

Далее нами проводилось сравнение информативности используемых в практической медицине прямых методов лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза у мужчин - световой микроскопии, культурального метода и полимеразной цепной реакции. При этом учитывались топика (уретрит и/или уретропростатит), длительность заболевания (до 2 месяцев - свежая форма, более 2 месяцев - хроническая), степень воспалительного процесса (количество лейкоцитов в отделяемом) мочеполовых органов. При оценке степени выраженности воспалительного процесса в мочеполовых органах все обследуемые мужчины в зависимости от количества лейкоцитов в отделяемом из уретры были распределены на три группы. В первой группе (45 мужчин) - с содержанием лейкоцитов в отделяемом из уретры до 20 единиц в поле зрения включительно, во второй (43 мужчин) - от 21 до 50 единиц в поле зрения включительно, в третьей (19 мужчин) - более 50 единиц в поле зрения. В случае обнаружения атипичных форм трихомониаза проводили повторные исследования с использованием культурального метода. Отсутствие типичных форм трихомонад в цитологических препаратах и в культуральных исследованиях являлось основанием для исключения диагноза урогенитальный трихомониаз [Иванов А.М., 2004]. trichomonas vaginali урогенитальный трихомониаз

По полученным данным, при различной локализации процесса, форме, выраженности воспалительного процесса наибольшей диагностической эффективностью в отношении T.vaginalis у мужчин обладала полимеразная цепная реакция, характеризующаяся достаточно высокой чувствительностью (81,9%) и специфичностью (88,6%), прогностической ценностью положительного (93,6%) и отрицательного результатов (70,5%) по сравнению с микроскопическим и культуральным методами (табл.1).

Однако статистически достоверными отличия полимеразной цепной реакции по чувствительности, специфичности, прогностической ценности положительного и отрицательного результатов при урогенитальном трихомониазе были только относительно микроскопии (p<0,01). Высокий показатель «разности риска» (64,1%) полимеразной цепной реакции свидетельствовал о высокой прогностической значимости результата данного метода, а высокий коэффициент асимметрии (35) - о значительной связи между прогнозом и исходом (наличием T.vaginalis у больного) исследования больного с урогенитальным трихомониазом.

Таблица 1 - Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза

Примечание:

^¦ Различие с данными микроскопического метода статистически значимо (p<0,01).

^¦¦ Различие с данными микроскопического метода статистически значимо (p<0,001).

ДЭ - диагностическая эффективность, ПЦ "-" - прогностическая ценность отрицательного результата, ПЦ"+" - прогностическая ценность положительного результата, РР - разность рисков, КА - коэффициент асимметрии.

Наличие ложноотрицательных (18,1%) результатов при проведении полимеразной цепной реакции, возможно, было связано с недостаточным количеством T.vaginalis в биоматериале, а ложноположительных (11,4%) - контаминацией отрицательных образцов при проведении исследования.

Чувствительность и прогностическая ценность отрицательного результата у культурального и микроскопического методов увеличивались с увеличением количества лейкоцитов в отделяемом из уретры, а специфичность и прогностическая ценность положительного результата - уменьшалась (p>0,05).

Следовательно, с увеличением количества лейкоцитов в отделяемом из

уретры у мужчин больных урогенитальным трихомониазом вероятность получения ложноположительных результатов культуральным и микроскопическим методами увеличивается. Комбинированное использование культурального и микроскопического методов диагностики также не исключает возможности завышения и занижения частоты выявляемости T.vaginalis за счет методических особенностей данных лабораторных исследований.

Комплексное применение прямых лабораторных методов обнаружения T.vaginalis позволило существенно увеличить вероятность обоснованности заключений о наличии или отсутствии возбудителя в организме.

Высокая диагностическая эффективность, специфичность, чувствительность, прогностическая ценность отрицательного и положительного результатов позволяют рекомендовать использование ПЦР для лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза у мужчин. На основании этих результатов нами были разработаны алгоритмы диагностики урогенитального трихомониаза, включающие молекулярно-генетические методы (ПЦР).

На следующем этапе нами были проведены электронно-микроскопические исследования клинических штаммов T.vaginalis от больных с хроническим трихомониазом, позволившие оценить степень полиморфности возбудителя. По нашим данным, клинические штаммы T.vaginalis при хроническом трихомониазе электронно-микроскопически характеризовались выраженной вакуолизацией, преобладанием электронно-прозрачных, лишенных содержимого везикул неправильной формы. Гидрогеносомы T.vaginalis значительно варьировали по размерам, форме и плотности содержимого, располагались хаотично по всему объему клетки. Эти данные указывают на формирование выраженных морфо-функциональных изменений у T.vaginalis при хронизации процесса, что осложняет традиционную лабораторную диагностику заболевания. В связи с этим представилось необходимым усовершенствование референтного метода диагностики урогенитального трихомониаза, которым является культуральный.

Культуральная диагностика урогенитального трихомониаза с использованием стандартных питательных сред отличается необходимостью продолжительной инкубации T.vaginalis (в среднем до 3-4 суток), существенно зависящей от величины посевной дозы. В связи с этим для сокращения сроков идентификации T.vaginalis культуральным методом нами была разработана собственная модификация состава питательной среды для кутивирования возбудителя. С этой целью в 5 мл жидкой питательной среды для выделения T.vaginalis (ООО НПФ «Диагност-мед», Россия) нами был добавлен комплекс железа [III] гидроксида полиизомальтозата (0,03 г) в виде жидкого лекарственного средства Феррум лек (LEK Pharmaceuticals, Словения). Применение данного состава питательной среды приводило на вторые сутки культивирования при температуре 37^oС к накоплению клеток в культуре до (6,5±2,1)х10³кл/мл, тогда как на контрольной среде в этот срок содержание T.vaginalis составило только (4,3±1,2)х10³кл/мл (p<0,01, рис.2).

Рис. 2. Сравнительная характеристика накопления T.vaginalis при их культивировании на модифицированной и контрольной среде. Ось ординат - количество клеток T.vaginalis (х10³ кл/мл), ось абсцисс - сроки инкубации (сутки).

На контрольной среде (ООО НПФ «Диагност-мед», Россия) максимальное накопление культуры T.vaginalis отмечалось на 3-и сутки в среднем до (5,3±1,4)х10³ кл/мл. При этом на 4-е сутки культивирования отмечалось снижение количества клеток до (5,0±1,2)х10³ кл/мл.

Применение модифицированной среды для культивирования T.vaginalis способствовало максимальному накоплению клеток на 4-е сутки в среднем до (9,0±2,7)х10³кл/мл, а снижение их количества отмечалось - на 5-е сутки культивирования в среднем до (8,0±2,6)х10³кл/мл.

Таким образом, культивирование клеток на модифицированной среде позволило идентифицировать T.vaginalis уже на 2-е сутки наблюдения (p>0,01), что приводило к сокращению сроков диагностики урогенитального трихомониаза.

Чувствительность и специфичность другого прямого метода идентификации T.vaginalis - ПЦР - во многом обусловлена правильным выбором мишеней для амплификации [Ryu J.S., 1999]. Известно, что наиболее исследованным локусами в геномах простейших являются гены рибосомальных РНК, отличающихся мультикопийностью (254 копий 18S рРНК/на клетку T.vaginalis) [Carlton J.M., 2007]. Учитывая наличие данного локуса в геноме T.vaginalis, представился целесообразным подбор для «классической» ПЦР и ПЦР «в реальном времени» высокочувствительных праймеров, не обладающих перекрестным реагированием с человеческой ДНК.