Материал: Методичка Часть 2 леч пед МПФ. Част МБ и ВИР

Методы микробиологической диагностики острых респираторных вирусных инфекций

А. Вирусоскопический

Материал со слизистой носа, зева эмульгируют в физиологическом растворе, осаждают и из осадка готовят мазки.

Мазки после высушивания обрабатывают типоспецифическими люминесцирующими сыворотками и микроскопируют с помощью люминесцентного микроскопа. Клетки, содержащие соответствующий вирус, адсорбируют специфические люминесцирующие антитела и светятся.

Б. Вирусологический (см. схему выше)

В. Серологический

Определяют нарастание титра специфических антител в исследуемых парных сыворотках с помощью РТГА, РСК и РН (см. схему).

Контрольные вопросы

Какие вирусы вызывают острые респираторные заболевания? Какие вирусы относятся к семейству ортомиксовирусов? Дайте общую характеристику ортомиксовирусов?

Какую структуру имеет вирион гриппа?

Какие микробиологические методы применяются для диагностики вирусных респираторных инфекций?

Вчем особенность серологических методов диагностики вирусных респираторных инфекций?

Как производится выделение вируса гриппа?

Как обнаруживается вирус гриппа в курином эмбрионе?

Как производится выделение и идентификация аденовирусов?

Вчем сущность РТГА? Каковы особенности ее постановки и учета результатов при обнаружении противогриппозных антител?

Вчем заключается сущность иммунофлуоресцентного метода диагностики гриппа?

Приложение к ЗАНЯТИЮ 13

А. Возбудители острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ). Возбудителями ОРЗ (кроме бактерий) являются следующие вирусы:

РНК-содержащие

1.Ортомиксовирусы (вирусы гриппа А, В и С).

2.Парамиксовирусы – парагриппозные вирусы, вирус эпидемического паротита, вирус ньюкаслской болезни, вирус кори, респираторно-синцитиальный вирус).

3.Пикорнавирусы (более 110 серотипов риновирусов, а также некоторые серотипы вирусов Коксаки А и В и вирусов ECHO).

4.Реовирусы (3-й серотип).

5.Коронавирусы ( в том числе возбудители SARS и MERS).

ДНК-содержащие вирусы

6. Аденовирусы (41 серотип, из них 8 являются возбудителями ОРВИ).

По частоте в порядке убывания: риновирусы – коронавирусы – респираторносинцитиальный вирус – парагриппозные вирусы – аденовирусы – вирусы гриппа. Однако основную роль играют вирусы гриппа, вызывающие частые сезонные вспышки, эпидемии и пандемии.

74

Вирусы гриппа обозначают по однородной кодированной системе. Указывают тип рибонуклеопротеида (род вируса) - А, В, С, географическое место выделения штамма; порядковый номер; год; в круглых скобка - подтип гемагглютинина (Н1-Н13) и нейрамидазы (NI - N10). Например, А /Сингапур/ 1/57 (Н2 N2); А /Гонконг/ 1/68 (НЗ N2); А /утка/

СССР/ 695/ 76 (Н3N2).

Б. Особенности вируса гриппа А Вирион имеет сферическую форму и диаметр 80–120 нм, его молекулярная масса

250 МД. Геном вируса представлен однонитевой фрагментированной (8 фрагментов) негативной РНК с общей м. м. 5 МД. Тип симметрии нуклеокапсида спиральный. Вирион имеет суперкапсид (мембрану), содержащий два гликопротеида — гемагглютинин и нейраминидазу, которые выступают над мембраной в виде шипов.

В. Для диагностики ОРВИ применяют следующие методы:

1.Вирусологический - заражение культур клеток и/или куриных эмбрионов.

2.Иммунофлуоресцентный (метод ускоренной диагностики).

3.Серологические реакции – как для обнаружения антител, так и для обнаружения вирусспецифического антигена – РТГА, РПГА, РСК, ИМФ.

4.Использование ПЦР.

З А Н Я Т И Е 14

Дата ______________

Тема: Микробиологическая диагностика полиовирусных инфекций,

Коксаки-инфекции, ротавирусных инфекций, бешенства, клещевого энцефалита

План занятия:

А. Микробиологический диагноз энтеровирусных инфекций

1.Вирусологический диагноз полиомиелита. Заражение вирусосодержащим материалом культуры клеток эпителия почки обезьяны.

а) регистрация роста вируса полиомиелита в клетках культуры ткани, цитопатический эффект; б) цветная реакция.

2.Серологический метод диагностики полиомиелита:

а) обнаружение типа и титра антител к вирусу полиомиелита методом цветной пробы (демонстрация); б) обнаружение противовирусных антител с помощью реакции преципитации (разбор).

Б. Микробиологический диагноз ротавирусных инфекций. Разбор схемы.

В. Микробиологический диагноз калицивирусных и норовирусных инфекций. Разбор схемы.

Г. Микробиологический диагноз клещевого весенне-летнего энцефалита. Разбор схем диагностики.

Д. Микробиологический диагноз бешенства. Разбор схемы исследования.

Методические указания

А. Микробиологический диагноз энтеровирусных инфекций

1. Вирусологический диагноз полиомиелита. Материалом для диагностики полиомиелита служат испражнения больного, готовят 10%-ную взвесь испражнений в растворе

75

Хэнкса, центрифугируют и надосадочную жидкость обрабатывают антибиотиками (1000 ед, пенициллина и 1000 ед. стрептомицина на 1 мл). Подготовленный таким образом материал смешивают со свежей питательной средой. Выросшую однослойную культуру ткани просматривают под микроскопом и отбирают пригодную для заражения. Стерильной пастеровской пипеткой отсасывают питательную среду. В культуру ткани вносят 1 мл материала в свежей питательной среде и пробирку ставят в горизонтальном штативе в термостат.

О наличии и размножении вируса полиомиелита в клетках культуры тканей узнают по цитопатическому эффекту: в результате размножения вируса клетки ткани гибнут и под микроскопом обнаруживаются дегенеративные изменения. Клетки образуют симпласты, часто округляются и отторгаются пластами от стенок пробирки. В культуре ткани, не зараженной вирусами, под влиянием продуктов метаболизма клеток рН среды изменяется в кислую сторону, и цвет индикатора меняется на желтый. Если в исследуемом материале имеется вирус полиомиелита, то клетки гибнут, рН среды меняется незначительно - среда сохраняет розовый цвет.

2. Серологический диагноз полиомиелита. Определение антител и их, титра к вирусу полиомиелита производят с помощью метода цветной пробы. Сыворотку больного полиомиелитом разводят в пробирках от 1:4 до 1:64 в объеме 0,25 мл. В каждую пробирку добавляют по 0,25 мл вируса полиомиелита и по 0,4 мл вазелинового масла. Через 40-60 минут в пробирки вносят по 0,25 мл клеточной суспензии, содержащей 100000 живых клеток в 1 мл. После инкубирования пробирок в термостате в течение 3-7 дней учитывают результат. Пожелтение среда в пробирках указывает на нейтрализацию вируса антителами и рост культуры клеток. Наибольшее разведение сыворотки, нейтрализующее вирус, является титром сыворотки.

Обнаружение противовирусных антител с помощью реакции преципитации

Реакция преципитации в агаре широко используется для диагностики вирусных заболеваний (полиомиелита, коксаки и др.) Реакция может быть поставлена в чашках Петри, на предметных стеклах и в капиллярах.

Постановка реакции преципитации на предметных стеклах. На обычные предметные стекла наносят 2 мл расплавленного и охлаждѐнного до 60°C агара (1%-ный агар на физиологическом растворе с 1:20000 мертиолята). Толщина слоя агара на стекле составляет около I мм. После застывания агара в нем вырезают лунки диаметром 3-4 мм с расстоянием между центрами луночек 5-6 мм. Количество луночек и их расположение на стекле могут быть различными в зависимости от условий опыта. Объем используемых ингредиентов 0,02 мл. Реакция ставится с несколькими контролями. Для определения антигена вируса вырезают 4 лунки (см. схему) и в каждую из них наливают соответственно следующие ингредиенты: специфическая сыворотка, специфический антиген, нормальная сыворотка, искомый антиген. Если искомый антиген соответствует сыворотке, то между соответствующими луночками должна появиться линия преципитации. Линия преципитации должна также появиться между лунками со специфической сывороткой и специфическим антигеном.

Преципитация наблюдается через 4-5 часов инкубации в термостате во влажной ка-

мере.

Схема постановки реакции преципитации в агаре для выявления вирусного антигена

76

Сс - сыворотка специфическая Сн - сыворотка нормальная Ас - антиген специфический Аи - антиген искомый

Схема определения титра антител нейтрализацией цветной пробы

Заключение: _________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

Контрольные вопросы

Какова классификация пикорнавирусов?

Дайте общую характеристику группы энтеровирусов.

Какие микробиологические методы применяют для диагностики полиомиелита и других энтеровирусных заболеваний?

Каков патогенез полиомиелита?

Как выделяют вирус полиомиелита от больных?

Какие серологические методы диагностики могут быть использованы при полиомиелите? Какие заболевания вызывают вирусы Коксаки и ЕСНО?

Какие способы применяются для обнаружения и выделения вирусов Коксаки? Как обнаруживают и идентифицируют вирусы Коксаки А и В?

В чем сущность реакции преципитации в агаре?

77