Материал: Методичка Часть 2 леч пед МПФ. Част МБ и ВИР

рогруппам – O1 и O139. Последний биовар включает прежние биотипы V. proteus и V. albensis и представлен многими другими сероварами вибрионов, которые не агглютинируются O1- и O139-сыворотками, т. е. НАГ-вибрионами. По О-антигену холероподобные (НАГ-) вибрионы разделяются на несколько десятков серогрупп. Могут вызывать холероподобные диареи. Вибрионы этих серогрупп идентифицируют с помощью соответствующих О-сывороток.

Б. Характеристика холерных и холероподобных вибрионов

63

Д. Холерный вибрион представлен тремя сероварами:

Ж. Определение холерогенности (энтеротоксигенности) V. cholerae

Косвенные признаки отсутствия холерогенности у вибриона:

1.наличие гемолитической активности,

2.отсутствие больных холерой;

3.отрицательные пробы с холерными диагностическими фагами (ХДФ-3, ХДФ-4, ХДФ-5).

Прямые методы обнаружения холерогена:

1.стимуляция клеточной аденилатциклазы в культурах клеток;

2.биологические пробы (на крольчатах-сосунках или на лигированной петле тонкого кишечника кролика);

3.реакция пассивного иммунного гемолиза (холероген взаимодействует с ганглиозидом эритроцитов, добавление антитоксинов и комплемента приводит к гемолизу);

4.иммуноферментный метод;

5.иммунофлуоресцентный метод;

6.ПЦР для обнаружения гена токсигенности.

З А Н Я Т И Е 11

Дата ______________

Тема: Микробиологическая диагностика анаэробных инфекций

(столбняк, ботулизм, газовая анаэробная инфекция)

План занятия:

1. Морфология анаэробных бактерий. Микроскопия препаратов-мазков из культур патогенных анаэробов.

2. Изучение особенностей роста культур анаэробов на различных питательных средах.

3.Микробиологический диагноз анаэробных инфекций. Разбор методов диагностики столбняка и газовой гангрены. Посев исследуемого материала по способу Вейон-Виньяля, Фортнера, на среду Китта-Тароцци. Регистрация результатов посева материала, содержащего анаэробные микробы, макро- и микроскопия выросших культур.

4.Ускоренное обнаружение С. реrfringens. Демонстрация роста на среде Вильсон-Блера, среде Китта-Тароцци и на молочной среде.

5.Биологическая проба на мышах для обнаружения ботулинического токсина. Разбор методики.

6.Демонстрация иммунопрепаратов, применяемых для профилактики и лечения анаэробных инфекций.

64

Методические указания

1.Готовые препараты-мазки из чистых культур патогенных анаэробов окрасить по Граму, промикроскопировать. Препараты зарисовать. Обратить внимание на характер расположения спор, отношение к окраске.

2.Демонстрация роста анаэробов на средах Виллиса-Хоббс, Китта-Тароцци, Виль- сон-Блера, Цейсслера, на молоке.

3.Для выделения чистых культур анаэробов берется раневое отделяемое. Исследование начинается с предварительной микроскопии исходного материала. Для этого готовят мазки и окрашивают по Граму. Обратить внимание на наличие капсул. Препараты зарисовать.

Посев производится на регенерированную, то есть предварительно прогретую на кипящей водяное бане в течение 10-20 мин для освобождения от растворенного в ней кислорода, среду Китта-Тароцци. Пастеровской пипеткой взять каплю гноя и, наклонив пробирку со средой Китта-Тароцци, по верхней стенке осторожно ввести каплю гноя на дно пробирки так, чтобы не попал воздух.

Зарегистрировать результаты посева материала, содержащего анаэробные микроорганизмы. Приготовить препарат-мазок, окрасить по Граму и зарисовать.

4.Посев раневого отделяемого на среду Вильсон-Блера. Среда Вильсон-Блера предварительно расплавляется и выдается студентам в пробирках. Перед посевом ее необходимо охладить до температуры 40-45°С. Раневое отделяемое предварительно развести в стерильном физиологическом растворе. Для этого каплю исследуемого материала внести

впробирку с физиологическим раствором. Затем после перемешивания из этой пробирки каплю внести в пробирку со средой Вильсон-Блера, тщательно перемешать путем вдувания и выдувания содержимого и быстро набрать среду в трубки Вейон-Виньяля. Трубки положить в горизонтальном положении и дать им остыть. Концы трубок закрыть ватой.

6.Демонстрация препаратов, применяемых для профилактики и лечения анаэробных инфекций.

Ускоренный метод диагностики возбудителей газовой гангрены по способу Комковой

Исследуемый материал вносят в 10 пробирок с полужидкой средой и затем 5 пробирок прогревают при 80ºC 20 минут. После этого в каждую пробирку добавляют различные моновалентные противогангренозные сыворотки.

Обнаружение через 10-18 часов микробов стрептобациллярной формы и роста их изолированными колониями подтверждает соответствие возбудителя типу сыворотки. Диффузный рост и беспорядочное расположение бацилл указывает на несоответствие возбудителя типу сыворотки.

65

Методы микробиологической диагностики ботулизма А. Бактериологический (по классической схеме с последующей

биологической пробой – см. ниже).

Методы микробиологической диагностики газовой гангрены Бактериологический

Исследование проб на наличие патогенных клостридий. Исследуемый материал.

Б. Биологический

Для обнаружения токсина и его типа в реакции нейтрализации.

Для обнаружения токсина двум мышам вводят исследуемый фильтрат в количестве 0,5 мл внутрибрюшинно, другим двум мышам вводят смесь, состоящую из 0,5 мл фильтрата и 0,2 мл смеси диагностических моновалентных противоботулинических сывороток типа А, В, С, Е (соединяют по 0,5 мл сыворотки каждого типа). Перед введением смесь испытуемого материала и сывороток выдерживают при комнатной температуре в течение 30 минут. Наблюдение за животными ведут в течение 4 дней. При наличии токсина погибают первые две мыши, остальные остаются живы.

66

При обнаружении токсина ставят развернутую реакцию нейтрализации для определения типа токсина. Для этого в 5 пробирок разливают по 2,4 мл испытуемого фильтрата и в каждую пробирку прибавляют по 0,6 мл сыворотки раздельно типа А, типа B, типа С и типа Е. В 5-ю пробирку прибавляют 0,6 мл физиологического раствора. Смесь после 30 минут выдерживания при комнатной температуре вводят внутрибрюшинно по 1 мл 2 мышам из каждой пробирки отдельными шприцами. Наблюдают за животными в течение 4 дней. При наличии токсина выживают мыши, получившие смесь токсина и гомологичной сыворотки, остальные мыши гибнут. Тип сыворотки, нейтрализующей токсин, указывает на типовую принадлежность токсина.

В. Ускоренные методы диагностики ботулизма

а) обнаружение токсина с помощью РПГА (на эритроцитах адсорбируют антиток-

син)

б) обнаружение токсина с помощью реакции угнетения фагоцитоза. Ботулинический токсин резко угнетает фагоцитарную способность лейкоцитов в связи с наличием у токсина лейкотоксических свойств. При этом фагоцитарный показатель уменьшается в 3, 5, 10 и даже 20 раз. При добавлении к крови, содержащей токсин, гомологичной антитоксической сыворотки фагоцитарная способность лейкоцитов восстанавливается.

Ускоренный метод обнаружения C. perfringens

Одна пробирка каждой среды после внесения материала прогревается при 80°С 20 минут.

Почернение среды Вильсон-Блера в течение 3-х часов и бурное створаживание молока («штормовая» реакция) в течение 6 часов характерны для C. perfringens.

67