На основании многолетних исследований комплексных вакцин можно сформулировать основные положения по конструированию и свойствам таких вакцин:
1) комплексные вакцины могут быть получены при многих сочетаниях однотипных и разнотипных моновакцин (живых, убитых, химических и пр.). Наиболее совместимыми и эффективными являются вакцины, сходные по физико-химическим свойствам, например белковые, полисахаридные, живые вирусные вакцины и др.;
2) теоретически число компонентов в ассоциированных вакцинах может быть неограниченным;
3) «сильные» в иммунологическом отношении антигены могут угнетать активность «слабых» антигенов, что зависит не от числа антигенов, а от их свойств. При введении комплексных препаратов может происходить запаздывание и быстрое угасание иммунного ответа на отдельные компоненты по сравнению с ответом на моновакцины;
4) дозы «слабых» антигенов в вакцине должны быть выше по сравнению с дозами других компонентов. Возможен и другой подход, который заключается в снижении доз «сильных» антигенов с максимального уровня до уровня средне эффективных доз;
5) в некоторых случаях наблюдается феномен синергии, когда один компонент вакцины стимулирует активность другого антигенного компонента;
6) иммунизация комплексной вакциной существенно не влияет на интенсивность иммунного ответа при введении других вакцин (при соблюдении определенного интервала после вакцинации комплексным препаратом);
7) побочная реакция организма на ассоциированную вакцину не является простой суммой реакций на моновакцины. Реактогенность комплексной вакцины может быть равной, несколько выше или ниже реактогенности отдельных вакцин.
К ассоциированным препаратам, выпускаемым в России, относятся вакцины АКДС, менингококковая А + С, а также АДС-анатоксины. Значительно большее количество ассоциированных вакцин выпускается за рубежом. К ним можно отнести: вакцину против коклюша, дифтерии, столбняка, полиомиелита (инактивированную) и гемофильной инфекции типа в-ПЕНТАктХИБ; вакцину против кори, краснухи, эпидемического паротита ? MMR, Приорикс. В настоящее время за рубежом проходят клинические испытания такие ассоциированные препараты, как 6-валентная вакцина, содержащая дифтерийный и столбнячный анатоксины, бесклеточную коклюшную вакцину, HBsAg, конъюгированный полисахарид Н. influenzae b, инактивированную полиомиелитную вакцину; 4-валентная живая вирусная вакцина против кори, краснухи, эпидемического паротита и ветряной оспы; комбинированная вакцина против гепатита А и В; гепатита А и брюшного тифа и ряд других препаратов. В последние несколько лет в России разработаны и находятся на стадии государственной регистрации новые ассоциированные вакцины: комбинированная вакцина против гепатита В, дифтерии и столбняка (Бубо-М) и комбинированная вакцина против гепатита А и В. В стадии разработки находится также комбинированная вакцина против гепатита В, дифтерии, столбняка и коклюша.
Новые технологии получения вакцин. Вакцины, получаемые с помощью методов генной инженерии. В 1980 г. проведены первые генно-инженерные эксперименты на вирусе простого герпеса человека, в 1981 г. ? на аденовирусе человека, а в 1982 г. ? на вирусе осповакцины. Сущность получения подобных препаратов заключается во встраивании гена, кодирующего определенное биологическое соединение, в вектор с помощью высокоспецифических ферментов ? рестрикционных эндонуклеаз, разрезающих ДНК вектора в строго определенных местах, и лигаз, вшивающих генную вставку в вектор. Следующий этап заключается в отборе клонов, несущих данный ген, и их размножении. Получаемые подобным образом клетки могут быть или разрушены с целью выделения и последующей очистки соответствующего антигена, что используется, например, при получении дрожжевых рекомбинантных вакцин против гепатита В, или вводятся в организм. Препараты последнего вида носят название векторных вакцин. Такой вектор после введения в организм прививаемого обеспечивает репликацию и экспрессию введенных генов с выделением больших количеств антигена. Непременное условие для подобного рода препаратов ? сохранение способности вектора к размножению в организме человека. Наибольшее количество векторных вакцин разработано на основе вируса вакцины и аттенуированных мутантных штаммов сальмонелл.
За рубежом получены рекомбинантные вирусы вакцины, способные к экспрессии антигенов вирусов кори, гепатита А и В, японского энцефалита, герпеса простого, бешенства, Хантаан, денге, Эпштейна ? Барр, рота вирусов, лепры, туберкулеза. При этом разработанные в США вакцины, предназначенные для профилактики кори, японского энцефалита, папилломатоза человека, геморрагической лихорадки с почечным синдромом (восточный серотип), уже проходят клинические испытания. Несмотря на то, что за рубежом в качестве вектора используют штаммы вируса вакцины с относительно низкой вирулентностью (NYCBOH, WR), практическое использование подобных рекомбинантных вакцин в значительной степени будет затруднено в связи с давно известными свойствами данного вируса вызывать развитие как неврологических (поствакцинальный энцефалит), так и кожных (вакцинальная экзема, генерализованная вакцина, аутои гетероинокуляция) форм поствакцинальных осложнений при обычно применяемом скарификационном способе вакцинации. При этом следует иметь в виду, что обе формы поствакцинальной патологии, особенно первая, значительно чаще развиваются при первичной вакцинации, а их частота находится в прямой зависимости от возраста прививаемого. Именно, в связи с этим для предотвращения осложнений в России разработана вакцина таблетированная оспенногепатитная В для орального применения, которая проходит первую фазу клинических испытаний.
Что касается сальмонеллезного вектора, то на его основе за рубежом созданы и изучаются препараты столбнячного и дифтерийного анатоксинов, вакцины для профилактики гепатита А, инфекций, вызванных ротавирусами и энтеротоксигенной кишечной палочкой. Естественно, что последние два рекомбинантных препарата в связи с энтеральным введением сальмонелл представляются весьма перспективными. Изучается возможность использования в качестве микробных векторов вируса оспы канареек, бакуловирусов, аденовирусов, вакцины БЦЖ, холерного вибриона.
Новый подход к иммунопрофилактике в 1992 г. предложили Танг с соавторами. Одновременно несколько групп ученых опубликовали в 1993 г. результаты своих работ, подтвердивших перспективность этого нового направления исследований, получившего название ДНК-вакцины. Оказалось, что в организм можно просто вводить (внутримышечно) препарат гибридной плазмиды, содержащей ген протективного вирусного антигена. Происходящий при этом синтез вирусного белка (антигена) приводит к формированию полноценного (гуморального и клеточного) иммунного ответа. Плазмида является небольшой кольцевой двухцепочечной молекулой ДНК, размножающейся в бактериальной клетке. С помощью генетической инженерии в плазмиду можно встроить необходимый ген (или несколько генов), который затем сможет экспрессироваться в клетках человека. Целевой белок, кодируемый гибридной плазмидой, продуцируется в клетках, имитируя процесс биосинтеза соответствующего белка при вирусной инфекции. Это приводит к формированию сбалансированного иммунного ответа против данного вируса.
Вакцины на основе трансгенных растений. С помощью методов генной инженерии представляется возможным «внедрить» чужеродные гены почти во все технические сельскохозяйственные культуры, получив при этом стабильные генетические трансформации. С начала 1990-х гг. проводятся исследования по изучению возможности использования трансгенных растений для получения рекомбинантных антигенов. Данная технология особенно перспективна для создания оральных вакцин, поскольку в этом случае рекомбинантные белки, образуемые трансгенными растениями, могут действовать непосредственно, вызывая оральную иммунизацию. Естественно, что это происходит в тех случаях, когда растительный продукт используется как пища, не подвергаясь при этом термической обработке. Помимо использования растений как таковых, образуемый ими антиген может извлекаться из растительного сырья.
В первоначальных исследованиях была использована модель: табак-HBsAg. Из листьев трансгенных растений выделен вирусный антиген, по своим иммуногенным свойствам почти не отличающийся от рекомбинантного HBsAg, продуцируемого клетками дрожжей. В дальнейшем получен трансгенный картофель, продуцирующий антиген энтеротоксигенной кишечной палочки и антиген вируса Norwalk. В настоящее время начаты исследования по генетической трансформации бананов и сои.
Подобного рода «растительные вакцины» весьма перспективны:
? во-первых, в ДНК растений может быть встроено до 150 чужеродных генов;
? во-вторых, они, будучи пищевыми продуктами, применяются орально;
? в-третьих, их использование приводит не только к образованию системного гуморального и клеточного иммунитета, но и к развитию местного иммунитета кишечника, так называемого иммунитета слизистых (mucosal immunity). Последний особенно важен при формировании специфической невосприимчивости к кишечным инфекциям.
В настоящее время в США проводится первая фаза клинических испытаний вакцины энтеротоксигенной кишечной палочки, представляющей собой лабильный токсин, экспрессированный в картофель. В ближайшем будущем технология рекомбинантных ДНК станет ведущим принципом конструирования и изготовления вакцин.
Антиидиотипические вакцины. Их создание коренным образом отличается от ранее описанных методик получения вакцин и заключается в изготовлении ряда моноклинальных антител к идиотипам молекул иммуноглобулина, обладающего проективной активностью. Препараты таких антиидиотипических антител по своей пространственной конфигурации подобны эпитопам исходного антигена, что позволяет использовать эти антитела взамен антигена для иммунизации. Подобно всем белкам, они способствуют развитию иммунной памяти, что весьма важно в тех случаях, когда введение соответствующих антигенов не сопровождается ее развитием.
Вакцины находятся в биодеградируемых микросферах. Инкапсуляция антигенов в микросферы представляет собой заключение их в защитные полимеры с образованием специфических частиц. Наиболее часто используемым для этих целей полимером является poly-DL-lactide-co-glycolide (PLGA), который в организме подвергается биодеградации (гидролизу) с образованием молочной и гликолевой кислот, являющихся нормальными продуктами обмена веществ. При этом скорость выделения антигена может варьировать от нескольких дней до нескольких месяцев, что зависит как от размеров микросфер, так и от соотношения лактида к гликолиду в диполимере. Так, чем большим будет содержание лактида, тем медленнее будет происходить процесс биодеградации. Поэтому при однократном применении смеси микросфер с коротким и длительным временем распада представляется возможным использовать подобный препарат и для первичной, и для последующей вакцинации. Именно этот принцип был использован при разработке препарата столбнячного анатоксина, который в настоящее время проходит клиническое испытание. В то же время следует отметить, что использование подобного препарата представляет определенную опасность при применении его у сенсибилизированного субъекта, у которого в ответ на вакцинацию возникнет тяжелая аллергическая реакция. Если бы подобная реакция развивалась при первом введении адсорбированного столбнячного анатоксина, то повторная вакцинация была бы ему противопоказана, между тем она неминуемо произойдет при применении микрокапсулой формы.
Помимо столбнячного анатоксина, в США в клинических испытаниях изучается микрокапсульная форма инактивированной гриппозной вакцины, предназначенной для парентерального применения.
Микрокапсулированные вакцины могут быть также использованы и при не парентеральных (оральном, интраназальном, интравагинальном) методах введения. В этом случае их введение будет сопровождаться развитием не только гуморального, но и местного иммунитета, обусловленного продукцией IgA-антител. Так, при оральном введении микросферы захватываются М-клетками, представляющими собой эпителиальные клетки пейеровых бляшек. При этом захват и транспортирование частиц зависят от их размера. Микросферы диаметром более 10 мкм выделяются пейеровыми бляшками, диаметром 5?10 мкм остаются в них и утилизируются, а диаметром менее 5 мкм диссеминируются по системе циркуляции.
Использование биодеградируемых микросфер принципиально позволяет провести и одномоментную иммунизацию несколькими антигенами.
Липосомальные вакцины. Липосомы были открыты в 1964 г. Липосомы представляют собой пузырьки с двухслойной мембраной, состоящей из фосфолипидов, их используют для транспортирования антигенов к антигенпрезентирующим клеткам. Размеры липосом варьируют от 0,01 до 150 мкм. Антигены могут включаться в липосомы в растворимой водной фазе или прикрепляться к мембране. При этом происходит как снижение их токсичности, так и более продолжительная циркуляция. Установлено также, что липосомы потенцируют иммунный ответ на включённый в них бактериальный, вирусный или паразитарный антиген, являясь, таким образом, иммунными адъювантами. Механизм усиления липосомами иммунного ответа на инкорпорированный антиген до конца не ясен. Высказывается мнение о том, что это связано с депонирующим эффектом ? медленным высвобождением антигена, а также способностью везикул и связанного с ними антигена мигрировать в региональные лимфатические узлы в месте инъекции и потенцировать иммунный ответ.
Наиболее распространённый метод изготовления липосом ? механическая дисперсия. При этой процедуре липиды (например, холестерин) растворяют в органическом растворителе (обычно в смеси хлороформа и метанола) и затем высушивают. К образующейся при этом липидной пленке добавляют водный раствор, в результате чего образуются многослойные пузырьки. Липосомы оказались весьма перспективной формой при использовании в качестве антигенов пептидов, поскольку они стимулировали при этом образование как гуморального, так и клеточного иммунитета. В настоящее время в ветеринарной практике используются липосомальные вакцины против болезни Ньюкастла и реовирусной инфекции птиц. В Швейцарии в Swiss Serum and Vaccine Institute впервые разработана лицензированная липосомальная вакцина против гепатита А ? Epaxal-Berna, проходят испытание липосомальные вакцины для парентеральной иммунизации против гриппа; гепатита А и В; дифтерии, столбняка и гепатита А; дифтерии, столбняка, гриппа, гепатита А и В.