Материал: Власов Ю.И., Ларина Э.И. Сельскохозяйственная вирусология

щихся первичным семеноводством картофеля, широко используется заражение отдельных листьев индикато­

во влажные камеры с определенным температурным режимом в зависимости от исследуемого вируса. Эта

заражаются в фазу двух-трех настоящих листьев, а в отдельных случаях—в фазу развития примордиальных (для вируса мозаики люцерны на фасоли) и семядоль­ ных листьев (для вируса некроза табака на огурце).

Однодольные растения (например, злаковые) более вос­ приимчивы к вирусам в фазе одного-двух листьев. Чув­ ствительность к вирусам повышается, если перед зара­ жением растения-индикаторы на 2...3 суток помещены

взатенение.

Вбольшинстве случаев растения-индикаторы зара­

жают механически — путем натирания листьев соком из испытуемого растения. Листья образцов растираются пестиком в фарфоровой ступке, предварительно продез­ инфицированной кипячением в течение 20 мин. При растнрании . листьев больных растений часто употребляют натриево-калийный фосфатный буфер от 0,1 до 0,01М с pH 7, так как большинство вирусов инактивируется при низком значении pH. Кроме того, для стабилизации вирусов в инокулюме применяют такие вещества, как уголь, аскорбиновую кислоту, сульфит натрия (0,5%), гипосульфит натрия (0,1 %), диэтилдитиокарбамат нат­

рия (0,01М), тиогликолиевую кислоту (0,1%), нико- тин-сульфат, никотин-основание, кофеин, Na-ЭДТА (этилендиаминотетраацетат натрия) и др.

Добавление в инокулюм или на поверхность листа до заражения абразивных веществ способствует более эффективному повреждению листовой поверхности и увеличению таким способом «ворот инфекции». В каче­ стве абразивов рекомендуют использовать карборунд (карбид кремния), корунд (окись алюминия) или це­ лит (диатомовая земля).

Инокулируемые листья натирают легкими движения­ ми поролоновой губки, смоченной в соке. Через не­ сколько минут инокулюм смывают водой из пульвери­ затора или промывалки. После внесения инфекции рас­ тения необходимо поместить в затененное место на 12...24 ч, чтобы они могли лучше перенести последствия травмирования при инокуляции. Наблюдения за инди­ каторами следует начинать через 1...2 дня после зара­

жения и проводить регулярно в течение четырех недель, обращая внимание как на инокулированные листья, так и на молодые, отрастающие. Признаки местной реак­ ции появляются через 3...12 дней после инокуляции, си­ стемной реакции — через 7...30 дней.

Электронная микроскопия. Метод электронной ми­ кроскопии является не только частью комплекса диа­ гностических приемов, но и используется при изучении биологии вирусов, особенностей взаимоотношений с j>ac-

?ейиями и переносчиками, а также при определении концентрации вирионов.

Первая электронная микрофотография вирусов была получена в 1939 г. Г. А. Қауше и Е. Пфанкух при про­ смотре‘очищенных препаратов ВТМ и ХВҚ. Интенсив­ ное применение электронной микроскопии в фитовиру­ сологии началось в 60-х годах нашего столетия, по ме­ ре совершенствования электронно-микроскопической техники и создания микроскопов с высокой разрешаю­ щей способностью.

Принцип устройства электронного микроскопа состо­ ит в следующем. Ток, проходящий через вольфрамовую нить, нагревает ее и вызывает эмиссию электронов. Вы­ сокое отрицательное напряжение, приложенное к нити, обусловливает значительную по величине разность по­ тенциалов между нитью и заземленной пластиной ано­ да. Разность потенциалов ускоряет движение электро­ нов по направлению к аноду, при этом часть электронов проходит через отверстие в центре анода (централь­ ную апертуру) и образует электронный луч, направляю­ щийся вниз по колонне микроскопа. Этот луч, сфоку­ сированный первой (конденсорной) магнитной линзой, освещает исследуемый препарат. Основная масса элек­ тронов проходит через объект без отклонения, но часть их рассеивается тяжелыми атомами изучаемого объекта и выбивается из общего электронного луча. Чем плот­ нее структура объекта, тем сильнее рассеиваются лучи. В результате формируется такая структура выходящего луча, которая при повторной фокусировке преобразует­ ся в изображение исследуемого объекта. Электроны, прошедшие через объект, фокусируются второй (объек­ тивной) магнитной линзой, которая создает увеличен­ ное изображение объекта. Полученное изображение уве­

В большинстве случаев фотографирование фйтовирусов проводится при их увеличении в 20...50 тыс. раз. При печати фотографии изображение можно еще увеличить в несколько раз.

При просмотре вирусов под электронным микроско­ пом на экране видно слабоконтрастное их изображение в связи с тем, что вирусные частицы вследствие малых размеров почти прозрачны для электронов и слабо их рассеивают. Для того чтобы изображение вирионов бы-

•jio четко видимым, используют контрастирование вирус­ ных препаратов при их приготовлении — напыление ме­ таллом (хром, вольфрам, золото, платина и др.) или так называемое негативное контрастирование с по­ мощью химических соединений (фосфорновольфрамо­ вая кислота — ФВҚ, вольфрамат натрия, молибденово­ кислый аммоний и др.). Негативное контрастирование открывает возможность для изучения внутренней струк­ туры вирусов.

При диагностике фитовирусов необходимо опреде­ лить форму и размер вирионов, для чего следует, как показали исследования ряда авторов, измерить не ме­ нее 100 вирусных частиц. Распределяя затем размеры вирионов по классам, определяют величину, наиболее часто встречающуюся, которую и принимают за типич­ ные размеры исследуемого вируса.

При приготовлении вирусных препаратов в качест­ ве предметных стекол, на которые обычно помещают объект исследования, используют специальные сетки диаметром 2...3 мм (в зависимости от типа микроско­

г о т о в л е н и я в и р у с н ы х п р е п а р а т о в .

Метод погружения. Пригоден для выявления ните­ видных, палочковидных вирусов в листьях, ростках, ко­ журе клубней. Край листа отрезают и место среза по­ гружают на 1— 2 с в каплю дистиллированной воды, на­

несенную на сетку с пленкой-подложкой. Аналогичным образом срезают кожуру клубня или росток (на высоте 7з от клубня) и место среза погружают в дистиллиро­

ванную воду. После высыхания капли препарат контра­ стируют металлом.

Метод разбавленной суспензии. Кусочек листа (1 см2

или 10...30 мг) тщательно растирают в фарфоровой ступ­ ке до получения однородной массы. Затем, продолжая растирать гомогенат, добавляют небольшими порция­ ми 10...20 мл дистиллированной воды. Получается одно­ родная разбавленная взвесь. Капля взвеси наносится на сетку и после высыхания напыляется металлом. Ме­ тод пригоден для стабильных палочковидных и ните­ видных вирусов, имеющих относительно высокую кон­ центрацию вирионов в тканях растения.

Приготовление препаратов лабильных вирусов. Диа­ гностика вирусов, имеющих нестойкие вирионы, сопря­