Материал: Власов Ю.И., Ларина Э.И. Сельскохозяйственная вирусология

жена с применением различных дополнительных прие­ мов, способствующих стабилизации вирусных частиц. Для этой группы патогенов, особенно обладающих ба­ цилловидной формой, необходимо использовать только негативное контрастирование.

Ряд авторов указывает на возможность сохранения структуры вирусов мозаики люцерны и вируса обыкно­ венной мозаики огурца путем обработки очищенных препаратов формалином перед негативным контрастиро­ ванием. Стабилизация вирионов возбудителя штрихова­ той мозаики пшеницы достигается посредством вакууминфильтрации внутрь тканей листьев 12%-ного раство­

ра глютаральдегида в течение 30 мин. Затем' суспензия из обработанных таким способом листьев негативно ок­ рашивается ФВҚ.

В Японии для сохранения структуры нестойких виру­ сов используется следующая методика. Кусочки листьев фиксируются в 5... 10%-ном растворе формалина 2...3 ч, после чего промываются в дистиллированной воде. За­ тем свежесрезанный край листа погружается в каплю 2%-ной ФВК на 2...3 с.

Для быстрой диагностики вируса русской мозаики озимой пшеницы Г. М. Развязкиной и Г. П. Поляковой (1967) предложен видоизмененный способ негативного контрастирования. В каплю 2%-ной ФВК с pH 6,5 по­ мещают мелко нарезанные кусочки листьев больных растений, затем через 2...3 мин раствор ФВК, в кото­ рый выходят вирионы, оттягивается пипеткой и нано­ сится на пленку-подложку. Усовершенствование выше­ изложенной методики, предложенное Э. И. Лариной (1974), заключается в предварительной стабилизации вирионов в тканях листьев путем фиксации их в 2 %-ном

растворе глютаральдегида. Поскольку раствор глюта­ ральдегида стабилизирует вирионы в клетках, после из­ мельчения ткани в каплю ФВК «выпадают» целые не­ измененные вирионы. Этим методом были выявлены воз­ будители линейного узора фундука, кольцевой мозаики тунга и др.

Успех быстрой диагностики возбудителей вирусных заболеваний растений (особенно механически не пере­ дающихся и имеющих биологический тип взаимоотно­ шений с переносчиком) во многом связан с предвари­ тельной фиксацией в тканях лабильных вирионов. К та­ ким вирусам в первую очередь относятся возбудители

болезней зерновых, риса, плодовых, субтропических культур.

При изучении особенностей репродукции вирусов в растениях и переносчиках широко используется метод ультратонких срезов. В последние годы все большее применение находит метод иммуноэлектронной микро­ скопии, сочетающий в себе серологию с электронной микроскопией. Обработка пленок-подложек специфиче­ скими антисыворотками дает возможность выявлять низкую концентрацию вирусов (в том числе при виру­ сологическом контроле растений, оздоравливаемых ме­ тодом верхушечной меристемы, при вирусологической экспертизе семян), а также дифференцировать морфо­ логически однородные вирусы (например, М- и S-виру­ сы картофеля и др.).

Анатомо-цитологический метод. Изменения морфоло­ гических признаков у вирозных растений являются ре­ зультатом патологических нарушений в строении тка­ ней и клеток. Различают три типа подобных изменений: 1) некротизация (отмирание клеток и тканей), 2) гипер­

плазия (чрезмерное разрастание ткани в результате из­ быточного деления клеток), 3) гипоплазия (подавление роста и дифференциации).

Наиболее часто изменения происходят в пластидах: уменьшаются их размеры, снижается содержание хло­ рофилла, часть пластид разрушается (например, при заболеваниях мозаичного типа). Одной из форм про­ явления цитопатологического действия вирусных инфек­ ций служит изменение структуры и формы ядер. Для ряда вирусов, в частности для ВТМ, ХВК, некроза та­ бака и гравировки табака, характерно повышенное со­ держание нуклеиновой кислоты в ядрах. При отдельных заболеваниях увеличивается число ядер в клетках по­ ражаемых растений. К примеру, в клетках паренхимы черешков махорки при поражении верхушечным хлоро­ зом, вызываемым вирусом бронзовости томата, насчиты­ вается от пяти.до семи ядер при норме 1...2. У сахар­ ной свеклы вирус курчавости верхушки способствует на ранней фазе развития заболевания повышению содер­ жания ядерного вещества и хроматина, увеличению раз­ мера ядер.

При поражении злаковых культур вирусом русской мозаики озимой пшеницы возрастает число ядрышек, наблюдается гипертрофия ядер, сопровождающаяся из­

менением их формы и вакуолизацией. При сравнений ядер эпидермиса з л а к о в , пораженных вирусами мозаи­

ки костра, штриховатой мозаики ячменя и полосатой мозаики пшеницы, сильная гипертрофия (увеличение размеров), а также заметные изменения внутренней

репродукции вирусов мозаики костра и штриховатой мозаики ячменя. Наличие аномальной формы ядер (овальная, веретеновидная, дуговидная) зарегистриро­ вано также при заболевании шарка слив на сливе и абрикосе.

Изменение формы и размеров ядер при вирусной ин­ фекции не всегда является четким диагностическим при­ знаком, однако оно может служить в ряде случаев кос­ венным приемом, например, в условиях эксперимента при дифференциации вируса полосатой мозаики от ви­ русов мозаики костра и штриховатой мозаики ячменя, а также для предварительной оценки на наличие виру­ са шарки слив в плодовых деревьях.

Патологическое действие многих вирусов на прово­ дящую систему растений проявляется в образовании некрозов флоэмы (L-вирус картофеля), развитии во флоэме аномальных ситовидных элементов (вирус кур­ чавости сахарной свеклы), появлении на сосудах кси­ лемы специфических лигнифицированных полос, назы­ ваемых внутриклеточными барьерами, а также в избы­ точном отложении полисахарида каллозы на попереч­ ных перегородках ситовидных трубок флоэмы (вирусы скручивания листьев, желтой карликовости ячменя и др.). Степень каллозообразования различна: от не­ большого утолщения поперечных перегородок до полной закупорки ситовидных трубок и образования сплошных каллозных тяжей. Каллоза при окрашивании ее крас­ кой резорциновый синий дает специфическую цветную реакцию, что служит диагностическим признаком и при­ меняется при выявлении вируса скручивания листьев картофеля.

Метод включений. Наиболее характерным цитопатологическим признаком при репродукции некоторых фи­ товирусов служит возникновение специфических обра­ зований — так называемых включений. Это явление легло в основу диагностического метода по внутриклеточ-

Природа II состав вирусных включений изучены не­ достаточно. Согласно современным представлениям, су­ ществует 4 основных типа внутриклеточных включений: 1) кристаллические включения, видимые в световой ми­

кроскоп и состоящие в значительной степени из более или менее правильно расположенных вирусных частиц; 2) аморфные включения, тоже видимые в световой ми­

кроскоп, но, помимо вирусных частиц, содержащие так­ же некоторые компоненты клетки растения-хозяина; 3) включения, состоящие исключительно из клеточных органелл; 4) включения, наблюдаемые только под элек­ тронным микроскопом и содержащие вирусный струк­ турный белок или неидентифицированный белок, упако­ ванный в виде волокон, трубочек, колесиков. Примером включений последнего типа служат включения в форме

прямоугольные, гексагональные (ВТМ, вирус мозаики красного клевера), восьмигранные (вирус гравировки табака), веретеновидные паракристаллы (вирус зеленой крапчатой мозаики огурца, подорожниковый штамм ВТМ), кристаллы в виде петель, игольчатые кристаллы (обнаруживаются при закукливании злаков — заболева­ нии, природа которого трактуется как вирусная и микоплазменная одновременно). Нередко один и тот же штамм вируса спосЪбен на одном растении образовы­ вать включения различной формы. В качестве примера можно назвать вирус гравировки табака, который обра­ зует зернистые включения в цитоплазме и кристалли­ ческие— в ядре, штаммы ВТМ, дающие при поражении кристаллы и аморфные образования, и т. д.

Морфологически Х-тела (аморфные включения) мо­ гут быть гомогенными, плотными без вакуолей (вирусы курчавости верхушки сахарной свеклы, американской мозаики озимой пшеницы) или рыхлыми, содержащими одну или несколько вакуолей (некоторые штаммы ВТМ,