Материал: Власов Ю.И., Ларина Э.И. Сельскохозяйственная вирусология

тел достигает максимума через две недели, а при вну­ тримышечном или подкожном —г через 4...8 недель.

Антисыворотки с более высоким титром, т. е. пре­ дельным разведением, при котором происходит реак­ ция с антигеном, получают после продолжительного введения антигена (3...4 инъекции с интервалами в 2...4 недели). Для повышения нммуногенностп чаще все­ го применяют адъювант Фрейнда, в состав которого входят убитые II высушенные клетки Mycobacterium b u ­ tyricum (0,05%), минеральное масло (85%), эмульги­ рующее вещество — маннидмоноолеат (15%).

При диагностике фитопатогенных вирусов использу­ ют два типа серологических реакций: преципитации и агглютинации. Наиболее распространенной является реакция преципитации — образование специфического осадка при взаимодействии антител с антигеном, пред­ ставляющим собой молекулы белка или полисахари­ дов. Реакция агглютинации сопровождается склеивани­ ем клеток (например, бактериальных) илй клеточных органелл под воздействием специфической антисыво­ ротки. Примером реакции агглютинации при серодиа­ гностике вирусов растений может служить латекс-тест.

Приведем описание нескольких с п о с о б о в с е р о ­ д и а г н о с т и к и .

Капельный метод. Принцип этого метода, получив­ шего широкое практическое применение, заключается в следующем. На стекло наносят каплю диагностической сыворотки и каплю нормальной сыворотки (т. е. сыво­ ротки из крови животного, не подвергавшегося введе­ нию антигена). К каждой из них добавляют по капле сока, отжатого из испытуемых растений, после чего сме­ шанные капли выдерживают во влажной камере при 22°С в течение 40 мин. В ряде случаев сок предвари­ тельно осветляется путем центрифугирования. Нор­ мальная сыворотка служит контролем, так как неред­ ко под воздействием высоких температур, видовых осо­ бенностей растений и.других факторов появляется не­ специфическая реакция с образованием осадка. Реакция считается положительной, если в капле с антисыворот­ кой виден четкий осадок, отсутствующий в капле с нор­ мальной сывороткой. Для чтения реакции использует­ ся бинокулярная лупа с увеличением в 20...25 раз.

Известны различные модификации этого метода с со­ кращенным расходом диагностических сывороток при

постановке реакций повышенной с помощью химически активных веществ чувствительностью. Так, например, методика серодиагностики, предложенная У. Хаманом п широко пспользуемая в первичном семеноводстве кар­ тофеля в ГДР, основана на повышении способности ви­ русных частиц реагировать с антителами при добавле­ нии сульфата аммония и коагуляции ннзкомолекулярных белков и других компонентов сока, мешающих реакции. Эта методика складывается из нескольких операций и заключается в следующем: в центрифуж­ ную пробирку вносится 0,3 мл сока II добавляется до­ зирующим шприцем 0,3 мл 4%-ного раствора сульфата аммония. В течение 1 ч смесь выдерживают при 27°С, затем центрифугируют 20 мин при 4500 g. Капли освет­ ленного сока наносят на стеклянную или плексиТлазовую пластинку и смешивают с сыворотками в соотноше­ нии 1:1. Смешанные капли, инкубируют 3 ч при 27°С во влажной камере. Результаты реакций читаются в темном поле бинокуляра при увеличении в 60...80 раз.

При использовании неосветленного сока образование преципитата сопровождается соединением хлоропластов в сгустки, в данном случае можно говорить о реакции преципитации — агглютинации. Разновидностью капель­ ного метода является реакция преципитации в про­ бирках.

Реакция двойной диффузии в геле (по Ухтерлони). Метод преципитации в геле, основанный на различной скорости диффузии в агаре молекул антигена и анти­ тел, в* настоящее время получил широкое применение для диагностики главным образом сферических вирусов и изучения взаимоотношений между штаммами вирусов. Палочковидные вирионы диффундируют между молеку­ лами агара значительно медленнее сферических, а ните­ видные вирусы до постановки реакций подвергаются де­ градации ультразвуком или химическим способом, с ис­ пользованием в качестве детергентов додецилсульфата Na, этаноламина и др.

Для постановки реакций в тонком слое агара на стеклянных пластинках вырезаются лунки: центральная и на расстоянии 1 1 , 5 см от нее несколько лунок, рас­ положенных радиально. В центральную помещается ан­ тисыворотка, в остальные — вирусный препарат или сок больных растений. Растворы антигена и антител диф­ фундируют навстречу -друг другу, и в случае наличия

Существуют разновидности этого метода — йммуноэлектрофорез и нммуноосмофорез. При иммуноэлектро­ форезе смесь антнгснов в агаре сначала разделяют дей­ ствием электрического поля, после чего траншею в ага­ ре, направленную параллельно движению антигенов под действием электрофореза, заполняют антисывороткой и проводят иммунодиффузию. При иммуноосмофорезе ви­ русный препарат помещают в лунку в жидком слое ага­ ра с определенным pH (6,8...7,6), а антисыворотку — в

лунку, расположенную на расстоянии около 2 см. На­ правление тока в электрическом поле должно прохо­ дить параллельно линии, соединяющей обе лунки. Если вирус заряжен отрицательно, он будет двигаться в на­ правлении лунки с антисывороткой, тогда как "антисыворотка под действием эндоосмоса будет перемещаться из своей лунки навстречу вирусу, в результате чего об­ разуются видимые полосы преципитации. Этот метод пригоден для вирусов с различной формой вирнонов.

Метод фиксации комплемента имеет ограниченное применение в фитовирусологии из-за трудоемкости и сложности, а также из-за наличия в большинстве рас­ тительных экстрактов веществ, тормозящих реакцию.

При постановке реакции фиксации комплемента со­ единение антигена с антителом обнаруживается посред­ ством системы индикаторов. В крови животного содер­ жится группа неспецифических компонентов (белки, ферменты), называемых комплементом. Комплемент мо­ жет вступать в реакцию при специфическом соединении л н т и г р н я и лнтитела. в таком случае он оказывается

связанным, но не способствует реакции преципитации. При введении кролику эритроцитов крови барана полу­ чается специфическая к ним сыворотка, содержащая комплемент. При смешивании с бараньими эритроцита­ ми она вызывает их лизис. Антисыворотка к бараньим эритроцитам, освобожденная от своего комплемента на­ греванием, называется гемолизином или гемолитиче­ ским амбоцептором.

Реакцию связывания комплемента проводят в две стадии. В первой — испытуемый антиген и антисыворот­ ку (с удаленным комплементом) смешивают в присут­ ствии постоянного количества стандартизированного комплемента из морских свинок, смесь инкубируют в течение 1 ч при температуре 37°С, чтобы' связывание комплемента прошло полностью. На второй стадии с

Помощью системы индикаторов определяют степень связывания комплемента, по которой судят о взаимо­ действии антигена с антителом. В качестве индикаторов используют промытые бараньи эритроциты и гемолизин, смесь выдерживают при 37°С и через разные проме­ жутки времени определяют степень лизиса эритроцитов.

Если вирусный антиген и антисыворотка прореаги­ ровали, весь комплемент оказывается связанным, лизи­ са эритроцитов не происходит; жидкая фаза испытуе­ мой системы остается бесцветной. В случае отсутствия серологической реакции между испытуемым вирусом и антисывороткой происходит лизис эритроцитов, раствор окрашивается гемоглобином в красный цвет. Степень окрашивания раствора зависит от концентрации ан­ тигена.

Нейтрализация инфекционности. При смешивании специфической сыворотки с вирусом резко снижается его инфекционность, без нарушения структуры. В неко­ торых случаях это может быть использовано при разде­ лении вирусов в смешанных инфекциях (например, ХВК и rattle-вирус на картофеле, rattle-вирус и ВТМ на то­ матах и перцах; вирус мозаики резухи и латентный ви­ рус кольцевой пятнистости земляники).

Данный прием делает также возможным изучение серологического родства между вирусами, передаваемы­ ми только тлями, служащего экспериментальным дока­ зательством явлення фенотипического смешивания ви­ русов.

Латекс-тест. Метод основан на добавлении к антнсыворотк# полимерного соединения латекс, которое ад­ сорбируется на поверхности антител и способствует аг­ глютинации при взаимодействии антиген— антитело, тем самым усиливая видимую реакцию. Чувствитель­ ность метода по сравнению с капельным возрастает в 100 и более раз. Техника постановки реакций аналогич­ на капельному методу.

Метод радиальной диффузии применим для диагно­ стики вирионов различной формы. Впервые И. Ф. Ше­ пард (1964, 1972) разработал и описал способ серодиа­ гностики ХВК, SBK и МВК, при котором вирионы под­ вергаются предварительной деградации 2,5%-ным пирролидином и вместо сывороток к целому вирусу исполь­ зуют антисыворотки, полученные к продуктам деграда­ ции вирионов. При постановке реакции к гелю добавля­