Материал: Власов Ю.И., Ларина Э.И. Сельскохозяйственная вирусология

ют вышеуказанную антисыворотку в определенном за­ ранее разведении.

Вцелях серодиагностики в агаровых пластинках вы­ резают антигенные лунки, в которые помещают смесь сока из испытуемого растения с 2,5%-ным раствором пирролидина в соотношении 1:4. Чтение реакции через 24—48 ч. При положительной реакции вокруг лунки образуется кольцо преципитации. Известна модифика­ ция этого метода (для сферических и палочковидных ви­ русов), при которой непосредственно в агар помещают кусочки анализируемых листьев.

ВГДР этот метод внедрен в практику семеновод­ ства картофеля при оздоровлении его от вирусов ХВК, SBK, МВҚ, УВК; применяют его и в качестве быстрого теста при диагностике шарки слив. По степени чувст­ вительности метод аналогичен капельному, но превос­ ходит его по производительности.

Энзимосвязанный иммуносорбентный тест (ЭЛИЗАтест) — высокочувствительный серологический метод, в основе которого лежит использование связанных с эн­ зимами антител для определения специфических антиге­ нов (т. е. вирусов растений). Применим для диагности­ ки вирусов с любой формой вирионов. Может быть ис­

пользован для выявления вирусов в семенах, а также

вплодовых и ягодных растениях.

Вкачестве энзимов , в фитовирусологии используют щелочную фосфатазу с ее субстратом р-нитрофенил фос­ фатом.

Принцип этого метода состоит в следующем: антитела, специфичные для определенного вида ви­

руса, адсорбируются на специальных пластиковых пла­ стинах с углублениями — колодцами (0,5 мм). С этой целью в колодцы добавляется раствор у-глобулиновой фракции антисыворотки;

после инкубирования неадсорбированные антитела отмываются и добавляется сок больного растения.-*Если вирус присутствует в соке, он будет реагировать с ад­ сорбированными антителами и, таким образом, связы­ ваться с пластинкой;

в колодцы прибавляется раствор, содержащий анти­ тела, связанные с энзимом. Если вирус находится в ко­ лодце, то он связывается с энзимом. При промывании удаляется несвязанный конъюгат и в колодец добав­ ляется энзимный субстрат.

После инкубационного периода измеряется актив­ ность энзима. Количество гидролизата прямо пропор­ ционально количеству вируса. Интенсивность окраски также пропорциональна концентрации вируса.

За рубежом ЭЛИЗА-тест апробирован и признан перспективным при диагностике шарки слив, тристезы цитрусовых, вируса обыкновенной мозаики огурца (в внрофорных тлях), мозаики сои, мозаики гороха (в се­ менах), крапчатости гвоздики, скручивания листьев картофеля, карликовой мозаики кукурузы, желтой кар­

ликовости ячменя и других вирусных болезней.

Метод растений-индикаторов. Индикаторным назы­

вают растение, которое дает четкую реакцию на дан­ ный вирус, сравнительно легко отличимую от реакции этого же вида растения на другие вирусы. Например, Nicotiana glutinosa L. является растением-индикатором на ВТМ. В ответ на заражение этим вирусом через 2—3 дня на. инокулированных листьях развиваются не­

кротические пятна. Название «индикатор на ВТМ» не означает, что N. glutinosa не поражается другими виру­ сами, однако ее реакция на ВТМ является специфиче­ ской.

Нередко для точного определения какого-либо виру­ са этим методом используется 2...3 вида растений-инди­ каторов. Бывают и такие случаи, когда один и тот же индикатор пригоден для диагностики нескольких ви­ русов.

По типу реакций растения-индикаторы подразделя­ ются на три группы: 1) растения с местной (локальной)

реакцией на заражение вирусом, проявляющейся толь­ ко па том листе (или листьях), который был инокулирован инфекционным соком, 2) растения-индикаторы с

системной реакцией, развивающейся в виде мозаики, деформации, различных узоров, некротических пораже­ ний и пр. на различных органах растения, и 3) рас­ тения-индикаторы со смешанной реакцией на вирус — сначала реакция проявляется на инокулированном ли­ сте, а через несколько дней инфекция развивается си­ стемно, по всему растению.

При диагностике методом индикаторных растений иногда используется способность вирусов системно за­ ражать (или, наоборот, не вызывать реакции) различ­ ные виды того же семейства, к которому относится ис­ пытуемое растение. Набор таких индикаторов, нося­

щих название растений-дифференциаторов, используется, например, при 'диагностике вирусов злаков, механи­ чески передаваемых только на растения семейства зла­ ковых (вирусы полосатой мозаики пшеницы, мозаики пырея, мозаики райграса и др.).

В число растений-индикаторов могут включаться растеннй, как поражаемые данным вирусом в природе, так и не поражаемые. Известно, напрнмер, что табак и огурец поражаются в природе мозаикой, вызванной ви­ русом обыкновенной мозаики огурца. Когда на огурцах обнаружена мозаика и требуется проверить, ие вызвана ли она указанным вирусом, то в качестве индикатора может быть использован табак. Наоборот, если найде­ на мозаика на табаке и требуется выявить этиологию заболевания, роль растения-индикатора может играть огурец. В то же время имеется индикатор, не поражае­ мый этим вирусом в природе. Это Chenopodium quinoa, реагирующий на вирус обыкновенной мозаики огурца образованием локальных пятен.

Метод растений-индикаторов пригоден также для диагностики смешанных вирусных инфекций и выделе­ ния отдельных вирусов из смеси, для определения кон­ центрации вирусов методом биологического титрования (в этом случае используются тест-растения с локаль­ ной реакцией на вирус).

Знание растений-индикаторов позволяет применять их для размножения вирусов с целью получения очи­ щенных вирусных препаратов, предназначенных для изучения морфологии вирионов и приготовления диа­ гностических сывороток. Например, N. clevelandi ис­ пользуют для размножения rattle-вируса (вируса по­ гремковости табака — возбудителя некроза клубней кар­ тофеля). Травянистые индикаторы — огурец сорта Дели­ катес и различные виды Chenopodium — применяют для накопления некоторых вирусов плодовых культур, а то­

маты сортов Невский и Звездочка — для получения ан­ тигена SBк.

Посредством индикаторных растений в ряде случаев представляется возможным выявление штаммовых раз­ личий вирусов.

Иллюстрацией может служить дурман (Datura stramo­ nium), который реагирует на обыкновенный штамм ХВК системной мозаикой на отрастающих листьях, в то вре­ мя как при поражении некротическим штаммом ХВК

наблюдается образование локальных и системных не­ кротических пятен и колец, Что приводит растение к преждевременной гибели. Кроме различий в симптомах на одном и том же виде индикатора, разные штаммы вирусов отличаются также кругом поражаемых ими рас­ тений-индикаторов. Например, есть штаммы вируса мо­ заики люцерны, поражающие огурцы, штаммы ВТМ, по­ ражающие яблоню, бобовые культуры, картофель.

Виды растений в различной степени восприимчивы к вирусам. В настоящее время для использования в ка­ честве индикаторов привлечено свыше 600 видов, отно­ сящихся к 43 семействам и 175 родам. Однако в прак­ тике фитовирусологии наиболее часто употребляют как индикаторные растения, принадлежащие к семействам пасленовых (Solanaceae), маревых (Chenopodiaceae), бобовых (Leguminosae), тыквенных (Cucurbitaceae), злаковые (Gramineae), амарантовых (Amaranthaceae). Среди представителей этих семейств есть такие индика­ торы, которые реагируютна многие вирусы. Из семей­ ства Solanaceae к таковым можно отнести Nicotiana tabacum L., N. clevelandi A. Gray, N. glutinosa' L„ N. debneyi L., Petunia hybrida Hort., Lycopersicon esculentum Mill., Datura stramonium L., Hyosciamus niger L., Physalis floridana Rydb., из семейства Chenopodiaceae — Chenopodium amaranticolor Costa et Reyn, Ch. quinoa Willd., Ch. murale L., из семейства Leguminosae — Phaseolus vulgaris L., Vicia faba L., Vigna sinensis Endi, из семейства Gramineae — Zea mays L., из семейства Ama­ ranthaceae — Gomphrena globosa L.

Примеры различных типов тест растений па вирусы,

ет выращивать изолированно, в теплицах на стерилизо­ ванной, хорошо удобренной почве. Большинство инди­ каторов (различные виды Табаков, дурман, гомфрена, физалис и др.) сначала высевают в горшки диаметром 25 см, а затем" пикируют по одному растению в горш­ ки диаметром 7...8 и 10...12 см. Горшки предварительно

дезинфицируют в 5%-ном растворе марганцовокислого калия или в 5— 10%-ном растворе тринатрийфосфата

(2—3 ч). Оптимальные условия для работы с растения- ми-индикаторами: температура воздуха 20,..25°С, осве­ щенность 2... 10 тыс. лк.