Ознакомиться с основными видами микроорганизмов, осуществляющими масляно-кислое брожение
Масляно-кислое брожение - это процесс анаэробного разложения углеводов масляно-кислыми бактериями с образованием масляной кислоты и других продуктов по уравнению:С6Н1206 > СН3СН2СН2СООН +2С02+2Н2. Кроме масляной кислоты, в процессе брожения в заметных количествах образуется уксусная кислота, а при смещении реакции в кислую сторону (до рН 5,5) - в больших количествах бутиловый спирт и ацетон. Энергетическим материалом для масляно-кислых бактерий служит крахмал, водорастворимые углеводы типа декстринов, ди- и моносахаридов, органические кислоты (молочная и пировиноградная) и спирты - манит и глицерин. В качестве источника азота они используют самые различные азотистые соединения; пептон, аминокислоты, аммиачные соли, а некоторые даже атмосферный азот.
Бактерии, вызывающие масляно-кислое брожение, относятся к роду Clostridium. Масляно-кислые бактерии широко распространены в почве (до 90 % почвенных образцов, как правило, содержат эти бактерии), навозе, загрязненных водоемах, на разлагающихся растительных остатках, в молоке, на поверхности растений и т. д.
В природе масляно-кислые бактерии полезны. Образующаяся масляная кислота в невысоких концентрациях является веществом, стимулирующим рост высших растений.
Масляно-кислое брожение происходит в природных условиях в гигантских масштабах: на дне болот, в заболоченных почвах, илах и всех тех местах, куда ограничен доступ кислорода. Благодаря деятельности масляно-кислых бактерий разлагаются огромные количества органического вещества. Однако масляно-кислое брожение часто приносит значительный ущерб, вызывая массовую порчу овощей при хранении, вспучивание сыра, порчу консервов, прогоркание молока.
Clostridium spp. входят в состав нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта (автохтонная микрофлора); иногда их обнаруживают на коже и в полости рта (аллохтонная микрофлора). К роду Clostridium относятся также весьма опасные патогенные виды: Сlostridium tetani - возбудитель столбняка, Сlostridium perfringens -возбудитель газовой гангрены, Сlostridium botulinum - продуцент экзотоксина, одного из самых сильных биологических ядов (ботулизм). Все виды рода объединены в группы в зависимости от способности сбраживать те или иные органические соединения.
Первая группа - сахаролитические виды Clostridium, сбраживающие растворимые углеводы, крахмал или пектин с образованием бутирата, ацетата, СО2 и Н2. Брожение при участии некоторых микроорганизмов группы приводит к образованию из сахаров дополнительных нейтральных соединений (бутанола, пропанола, ацетона, небольших количеств этанола). В группу входят бактерии, вызывающие масляно-кислое и ацетонобутиловое брожения: С. pasteurianum, С. tyrobutyricum, С. butylicum, С. acetobutylicum и др.
Вторая группа - протеолитические виды Clostridium, сбраживающие аминокислоты. Обладают сильными протеолитическими свойствами и способны к интенсивному гидролизу белков с последующим сбраживанием аминокислот. Рост микроорганизмов средах с белком сопровождается образованием аммиака, СО2, Н2, жирных кислот и большого количества летучих соединений с неприятным запахом.
К группе относятся виды: С. sporogenes, С. регfringens, С. histolyticum, С. botulinum и др. Многие представители рода Clostridium, сбраживающие аминокислоты, способны также к сбраживанию углеводов.
Третья группа - виды Clostridium, сбраживающие азотсодержащие циклические соединения - пурины и пиримидины. Пурины (гуанин, гипоксантин, ксантин и др.) под влиянием С. acidi-urici и С. cylindrosporum превращаются в аммиак, ацетат и СО2. С. oroticum сбраживает пиримидины, при этом урацил распадается до аланина, СО2 и NH3, а оротовая кислота - до уксусной кислоты, СО2 и NH3.
Четвертая группа включает всего один вид - С. kluyveri, сбраживающий смесь этанола с ацетатом до бутирата и капроновой кислоты, а также небольшого количества водорода.
Получить накопительную культуру бактерий рода Clostridium, осуществляющих маслянокислое брожение
Получение накопительной культуры маслянокислых бактерий рода Clostridium проводят с использованием нечищеных клубней картофеля, на поверхности которых высока вероятность присутствия бактерий этого рода. Измельченные клубни помещают в водную среду, куда добавляют мел для создания нейтральной среды, так как масляно-кислые бактерии относятся к нейтралофилам. Чтобы в этой среде развивались преимущественно маслянокислые бактерии, следует создать в ней строго анаэробные условия и подвергнуть среду пастеризации (прогреванию при температуре около 80 єС в течение 10-15 мин). При нагревании споры маслянокислых бактерий остаются жизнеспособными, а попавшие с почвой неспорооразующие бактерии погибают.
Изучить морфологию бактерий, осуществляющих маслянокислое брожение
В настоящее время среди представителей Clostridium насчитывается более 80 видов бактерий. Они являются строгими (облигатными) анаэробы, представляют собой подвижные крупные палочки (перитрихальный тип жгутикования) с клостридиальным или плектридиальным типом спорообразования (рис. 11). У видов рода образуются споры, имеющие овальную или сферическую форму; они терморезистентны.
Окраска по Граму - положительная. Очень чувствительны к кислотности среды, оптимум рН 6,9-7,3. При рН ниже 4,9 прекращают развиваться. Характерная особенность маслянокислых бактерий - способность накапливать в клетках гранулезу в период образования спор и перед ним.
А Б В
Рисунок 11 Типы спорообразования у бактерий: А - бациллярный, Б - клостридиальный, В - плектридиальный
Род включает психрофильные, мезофильные и термофильные виды.
Температурный оптимум для роста большинства мезофильных видов лежит в диапазоне 30-40 °С. Для термофильных видов температурный оптимум составляет 60-75 °С. Оптимальная реакция среды для клостридий -нейтральная или слабощелочная. Типичный представитель маслянокислых бактерий - Clostridium butyricum. Это крупная палочка (1-2Ч10 мкм). Молодые клетки подвижны, на более поздних стадиях развития они теряют жгутики, приобретают веретенообразную форму и накапливают запасное питательное вещество - полисахарид гранулезу. При образовании спор клетки приобретают веретеновидную форму, иногда форму барабанной палочки.
Вопросы к лабораторной работе
1. Какие виды масляно-кислого брожения вам известны?
2. Какие микроорганизмы, осуществляющие масляно-кислое брожение вы изучали, их морфологические и биохимические свойства?
3. Каким образом производится получение накопительной культуры масляно-кислых бактерий рода Clostridium?
4. Как происходит спорообразование у бактерий рода Clostridium?
Получить накопительную культуру масляно-кислых бактерий:
1. Неочищенный картофель нарезать ломтиками, которые могут легко войти в пробирку.
2. Заполнить ими пробирку на 1/3 объема, добавить щепотку мела и заполнить водой почти до верха. Закрыть ватной пробкой.
3. Пробирки поместить в водяную баню при температуре 80 °С на 10-15 мин.
4. Вынуть ватные пробки и быстро заменить их резиновыми, проводя последние через пламя спиртовки и обжигая край пробирок.
5. Затем пробирки закрыть пробками и ставить в термостат с температурой 35 °С на 2-3 дня.
6. При этих условиях в жидкости обнаруживают бактерии масляно-кислого брожения. Элективные условия для прохождения в опыте масляно-кислого брожения:
1) наличие крахмала как специфического источника углерода, который используется только микроорганизмами, содержащими фермент амилазу, вызывающую гидролиз крахмала до глюкозы;
2) присутствие масляно-кислых бацилл на поверхности картофеля;
3) анаэробные условия под высоким столбиком жидкости;
4) нейтральная среда за счет внесения мела;
5) пастеризация, позволяющая отделить масляно-кислые бациллы от не споровых форм.
Исследовать микроорганизмы масляно-кислого брожения:
1. С помощью пипетки взять жидкость со дна пробирки, приготовить препарат «раздавленная капля» с добавлением раствора Люголя и «висячую каплю».
2. Культуру микроскопировать, в ней обнаруживается главным образом Clostridium pasteurianum - подвижные палочки с закругленными концами, одиночные и парные. В старых культурах у одного из концов клетки обнаруживается спора.
Исследовать спорообразование по Ауэски, результаты занести в табл. 1.
1. Сделать рисунок.
2. С культуральной жидкостью проводят качественную реакцию на масляную кислоту. Для этого к 5 мл жидкости добавляют 2 мл 5 %-ного хлорного железа. При нагревании образуется масляно-кислое железо коричневого цвета.
Морфология масляно-кислых бактерий
Метод, использованный для изучения морфологии
Внешний вид препарата при микроскопировании
«Висячая капля»
«Раздавленная капля» с раствором Люголя
Метод Ауэски для выявления спорообразования
Сделать обобщающий вывод по результатам исследования.
ВОЗБУДИТЕЛИ АНАЭРОБНЫХ ИНФЕКЦИЙ: СТОЛБНЯКА, БОТУЛИЗМА, ГАЗОВОЙ ГАНГРЕНЫ
Возбудитель стобняка
Таксономия
Семейство Bacillaceae, род Clostridium, виды C.tetani.
Морфологические и тинкториальные свойства
Грамположительная прямая палочка диаметром 0,5-1,1 мкм, перитрих. Капсул не образует. В мазках располагаются одиночно или цепочками.
Споры. Круглые, реже овальные, расположены терминально. Их диаметр в 2-3 раза превышает толщину бактерий, вследствие чего они напоминают «теннисные ракетки» или «барабанные палочки».
Культуральные свойства
Хемоорганотроф. Строгий анаэроб. Температурный оптимум 37єС.
На среде Китта-Тароцци рост медленный с равномерным помутнением и редким газообразованием. Культура издает неприятный запах выгребной ямы.
На кровяном агаре колонии круглые, плоские, с неровными краями, серые, вокруг колоний зона гемолиза.
В столбике сахарного агара колонии в виде комочков ваты.
На МПА и желатине возбудитель растёт медленно и образует тонкие прозрачные колонии двух типов: гладкие, прозрачные S-колонии и серовато-жёлтые, шероховатые R-колонии.
S-колонии образуют отростки, придающие им паукообразную форму.
Позднее отростки сливаются, образуя «сеточку» на поверхности среды.
При посеве столбиком в полужидкий агар через 24-48 ч S-колонии имеют вид пушинок с плотным коричневым центром; R-колонии имеют вид чечевичек.
Среда Цейсслера.
Биохимические свойства
Обладает слабыми протеолитическими свойствами - медленно гидролизует желатин, молоко свертывает к 4-7 дню в виде мелких хлопьев, не образует индола.
Восстанавливает нитраты в нитриты.
Сахаролитических свойств нет, лишь редкие штаммы ферментируют глюкозу, лактозу.
Не образуют каталазу и оксидазу.
Антигенная структура
О- (общий) и Н-антигены (типоспецифический). По Н-антигену различают более 10 серотипов.
Факторы патогенности
Главным фактором патогенности является вырабатываемый экзотоксин, который состоит из двух фракций - тетаноспазмин (нейротоксин) и тетанолизин (разрушает эритроциты).
Тетанолизин - мембранотрпный токсин, разрушает эритроциты, подавляет фагоцитоз, обладает кардиотоксическим и летальным действием.
Тетаноспазмин - полипептид, специфически связывается с нервными клетками в области их мионевральных синапсов.
Продвижение токсина происходит от нейрона к нейрону через синапсы, в результате, токсин накапливается в центральной нервной системе в двигательных зонах спинного и головного мозга. Он блокирует синаптическую передачу - тормозит освобождена медиаторов, таких как глицин, ацетилхолин, норадреналин и вызывает тонико-клоническое сокращение мышцы.
Тетаноспазмин чувствителен к кислороду, солнечном свету и нагреванию.
Резистентность
Вегетативные формы разрушаются при кипячении в течение 5 мин. Споры устойчивы к низким температурам, солнечному свету, к химическим веществам (1% сулема, формалин, 5% фенол уничтожают их через 14 часов). В почве могут сохраняться десятки лет, а при благоприятных условиях прорастать и размножаться.
Эпидемиология
Возбудитель распространен повсеместно в почве.
Основной путь передачи - контактно-раневой через поврежденные кожные покровы и слизистые оболочки. Основная группа риска - работники сельского хозяйства.
Больной столбняком человек неконтагиозен
Входными воротами служат различные раны: огнестрельные, колотые, резаные, занозы, потертости, ожоги, обморожения, операционные, травмированные родовые пути.
Выделяют также столбняк новорожденных, связанный с попаданием через пупочный канатик земли, глины, навоза и других субстратов. Летальность при этой форме составляет 85% идостигает максимальных значений на 6-8 день жизни больного ребенка.
Патогенез и клиническая картина
Заболевание начинается после прорастания в ране спор возбудителя и продуцирования вегетативными клетками описанных токсинов, которые гематогенным путем разносятся по организму.
В клинической картине ведущими симптомами являются - тоническое сокращение поперечнополосатый мускулатуры и повышенная рефлекторная возбудимость от внешних раздражений.